口蹄疫病毒RT-PCR快速檢測(cè)方法的建立

張書(shū)光 丁 宏 李乙江 楊 科 普仕華 高花英 李佳赟

（德宏州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南德宏　678400）

口蹄疫病毒RT-PCR快速檢測(cè)方法的建立

張書(shū)光 丁 宏 李乙江 楊 科 普仕華 高花英 李佳赟*

（德宏州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南德宏678400）

目的：建立了一種RT-PCR的方法，用于檢測(cè)O、A和亞洲I型口蹄疫病原。方法：設(shè)計(jì)合成一套引物，通過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立RT-PCR的方法，以擴(kuò)增口蹄疫病毒的基因，并用該法檢測(cè)患病豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）等樣品。結(jié)果：該方法可快速靈敏檢測(cè)出豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）中的FMDV，并具有較好的特異性和重復(fù)性。結(jié)論：建立了一種RT-PCR檢測(cè)O、A和亞洲I型口蹄疫病原的方法。

口蹄疫病毒RT-PCR快速檢測(cè)方法

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起如黃牛、豬、綿羊、山羊等偶蹄動(dòng)物感染的一種熱性、接觸性、烈性傳染病，被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類(lèi)重要傳染病之首。該病的發(fā)生和流行嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此世界各國(guó)相當(dāng)重視對(duì)該病的研究和防治。該病對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)危害性極大，是世界各國(guó)檢疫和防疫的重點(diǎn)對(duì)象。

德宏州地處云南滇西邊境，與緬甸毗鄰，邊境線全長(zhǎng)503.8km，邊境線無(wú)人工和天然屏障，中緬貿(mào)易相互往來(lái)，牧場(chǎng)共用。全州有兩個(gè)國(guó)家一類(lèi)口岸，兩個(gè)二類(lèi)口岸，28個(gè)渡口，64條通道，是我國(guó)東南亞的主要窗口和重要樞紐。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，從境內(nèi)、外輸入我州的偶蹄動(dòng)物數(shù)量不斷增加，在我州進(jìn)行短期育肥后屠宰再進(jìn)行貿(mào)易和消費(fèi)，從而對(duì)我州的動(dòng)物疫病防控帶來(lái)了極大風(fēng)險(xiǎn)。因此口蹄疫病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立已迫在眉睫。

1　材料與方法

1.1陽(yáng)性病料和引物設(shè)計(jì)、合成

陽(yáng)性病料和O、A和亞洲I型檢測(cè)引物由云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。引物擴(kuò)增片段大小為450bp。

1.2儀器設(shè)備、酶和試劑盒

核酸自動(dòng)提取儀NP968-S（西安天?。饎?dòng)球磨儀GT200（格瑞德曼），PCR儀（德國(guó)耶拿），Syngene凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP），Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒（西安天隆），PrimeScript? One Step RT-PCR Kit（TAKARA）。

1.3總RNA的提取

分別應(yīng)用西安天隆科技有限公司生產(chǎn)的Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒和從豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）中提取總DNA/RNA，具體操作過(guò)程見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.4RT-PCR

RT-PCR體系：

Enzyme　Mjx　2μl 2×1 Step Buf fer 　25μl上游引物（20 μM） 　1μl（0.4μM/μl）下游引物（20 μM） 　1μl（0.4μM/μl）提取的總RNA 　1μl RNa s e F r e e d H 2O 　Up t o 5 0?μl

反應(yīng)條件：

50℃30 min

94℃2 min

94℃30 sec

55～65℃30 sec25～30 Cycles

72℃1 min/kb

1.5PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)

取5～10μl擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠（含0.5%μg/m l 花青素）。配膠及電泳緩沖液均為1×TAE（0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA，pH8.0），200V電泳30～40min，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察PCR產(chǎn)物在凝膠中的位置，以DL2，000DNA Marker為參照物，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量，判定結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1樣品處理

口蹄疫病毒的嗜好組織為：豬的頜下淋巴結(jié)和扁桃體，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）。樣品處理的好壞直接會(huì)影響到核酸的提取效果。目前常用的方法是組織研磨磨碎后反復(fù)凍融，12000rpm離心5min取上清，牛、羊的食道-咽分泌物（O-P液）直接12000rpm離心5min取上清。由于手工研磨費(fèi)時(shí)費(fèi)力，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)組織提取方法進(jìn)行比對(duì)，采用震動(dòng)球磨儀GT200自動(dòng)研磨和手工研磨兩種方法，結(jié)果如下：

自動(dòng)研磨和手工研磨　耗費(fèi)時(shí)間球磨儀　2mjn/24份+1mjn/份手工　3mjn/份

當(dāng)樣品≤8時(shí)，直接用人工研磨的更加快速。當(dāng)樣品數(shù)＞8時(shí)，震動(dòng)球磨儀GT200研磨出的樣品比人工研磨的更加快速。

2.2RNA提取方法的建立

目前常用的核酸提取方法包括手工提取法（吸附柱法）和核酸自動(dòng)提取儀提取法（磁珠法），將兩種方法提取的核酸電泳檢測(cè)比對(duì)發(fā)現(xiàn)兩種方法均可以提取出較高質(zhì)量的RNA，均符合本實(shí)驗(yàn)要求。

手工和核酸自動(dòng)提取儀RNA提取效果圖

從左到右依次為：Marker、手工1號(hào)RNA、手工2號(hào)RNA、自動(dòng)提取儀1 號(hào)RNA、自動(dòng)提取儀2號(hào)RNA

O、A和亞洲I型三對(duì)引物梯度PCR效果圖

從左到右依次為：Marker、55（O、A、亞洲I）、57（O、A、亞洲I）、58（O、A、亞洲I）、59（O、A、亞洲I）和60℃（（O、A、亞洲I））2.3RT-PCR 方法的建立

為了確定O、A和亞洲I型三對(duì)引物的退火溫度，分別對(duì)三對(duì)引物進(jìn)行了梯度PCR擴(kuò)增，通過(guò)幾輪梯度PCR，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)O、A和亞洲I型三對(duì)引物的最佳退火溫度均為60℃。

3　討論

目前常規(guī)檢測(cè) FMD 的技術(shù)主要有動(dòng)物接種、病毒分離和血清學(xué)試驗(yàn)等方法，上述方法有的費(fèi)時(shí)長(zhǎng)達(dá)幾天至數(shù)周（如動(dòng)物接種）、有的需細(xì)胞培養(yǎng)等條件（如血清中和試驗(yàn)）、有的存在非特異性反應(yīng)（如熒光抗體試驗(yàn)）和敏感性低（如瓊擴(kuò)）等缺點(diǎn)。這些方法難于滿足口岸動(dòng)植物檢疫部門(mén)及基層獸醫(yī)檢疫部門(mén)對(duì)進(jìn)出口動(dòng)物、畜產(chǎn)品（主要是肉、奶等）、痊愈動(dòng)物帶毒及亞臨床感染的檢測(cè)。因此，我們建立了一種可快速準(zhǔn)確檢測(cè)FMDV的RTPCR 技術(shù)。

目前RT-PCR檢測(cè) FMD 的技術(shù)主要環(huán)節(jié)為樣品處理、核酸提取和穩(wěn)定的檢測(cè)引物三個(gè)方面。本實(shí)驗(yàn)對(duì)三個(gè)環(huán)節(jié)均進(jìn)行了大量的摸索，發(fā)現(xiàn)震動(dòng)球磨儀GT200研磨出的樣品1500轉(zhuǎn)3min可以將組織均勻打碎，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和可參比性。核酸自動(dòng)提取儀提取法（磁珠法），可以提取出較高質(zhì)量的RNA，鑒于磁珠法方便快捷全自動(dòng)，半個(gè)小時(shí)可以完成32份樣品的核酸提取，因此磁珠法更適用于各州市縣動(dòng)物疫控中心的大批量監(jiān)測(cè)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，O、A和亞洲I型三對(duì)引物的最佳退火溫度均為60℃，使用該退火溫度，檢測(cè)條帶清晰明亮，可有效避免假陽(yáng)性和假陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)，同時(shí)，為了質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，可在實(shí)驗(yàn)時(shí)做陰陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照可用商品弱毒疫苗提取核酸，陰性對(duì)照可用雙蒸水。