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    多巴胺脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥治療帕金森氏病的研究

    2016-10-27 03:47:41趙麗妮葉夢(mèng)于洋王俊平
    生物技術(shù)世界 2016年2期
    關(guān)鍵詞:中樞脂質(zhì)體多巴胺

    趙麗妮 葉夢(mèng) 于洋 王俊平

    (沈陽醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 遼寧沈陽 110034)

    多巴胺脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥治療帕金森氏病的研究

    趙麗妮 葉夢(mèng) 于洋 王俊平

    (沈陽醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 遼寧沈陽 110034)

    目的: 研制多巴胺脂質(zhì)體,用于治療帕金森氏病。方法: 用大豆卵磷脂和油酸制備多巴胺脂質(zhì)體;采用昆明種小白鼠,腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)建立帕金森氏病動(dòng)物模型,用于評(píng)價(jià)多巴胺脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥的治療帕金森氏病的療效。結(jié)果:多巴胺脂質(zhì)體的平均粒徑為20-120nm, Zeta電位為-25.6mV,對(duì)多巴胺的包封率為(98.2±1.6)%(n =3);經(jīng)鼻給藥,多巴胺脂質(zhì)體具有顯著的抗帕金森氏病作用(p<0.05)。結(jié)論: 采用大豆卵磷脂、油酸可以制備出多巴胺脂質(zhì)體,經(jīng)鼻給藥用于治療帕金森氏病有效。

    多巴胺 脂質(zhì)體 經(jīng)鼻給藥 帕金森氏病

    帕金森氏?。≒arkinson's disease, PD) 是一種神經(jīng)退行性運(yùn)動(dòng)功能障礙性疾病。PD的病理改變主要是中腦黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性凋亡。因此,PD的治療策略之一是補(bǔ)充腦內(nèi)多巴胺。然而,多巴胺不能通過血腦屏障,因此目前尚不能用多巴胺治療PD。鼻腦通路可以讓藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞,其機(jī)制可能有:嗅上皮毛細(xì)血管吸收小分子脂溶性藥物后穿過血腦屏障進(jìn)入中樞,通過伸入顱內(nèi)嗅覺壺腹的嗅覺感受細(xì)胞間的細(xì)胞軸突轉(zhuǎn)運(yùn),也可能通過鼻粘膜嗅上皮細(xì)胞之間的裂孔進(jìn)行細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)。有文獻(xiàn)報(bào)道,脂質(zhì)體等藥物載體經(jīng)鼻給藥可讓其攜帶的藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞[1-3]。因此,我們制備了多巴胺脂質(zhì)體,目的是通過經(jīng)鼻給藥治療帕金森氏病。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    P200II型高效液相色譜附UV200II型紫外可變波長檢測(cè)器(大連伊力特分析儀器有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器附SHZ-CD型循環(huán)水真空泵 (上海亞榮生化儀器廠);TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);激激光粒度/Zeta 電位分析儀(ELS800,日本);JEM透射-掃描電鏡(日本電子光學(xué)公司)。

    1.2 藥品與試劑

    多巴胺(志望化工有限公司,批號(hào):20140812), 大豆卵磷脂(Sigma) ,油酸(上海生物,批號(hào):20140602) ,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康雌性昆明種小白鼠,體重18-22g(沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào) SC XK(遼20010103)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 多巴胺脂質(zhì)體的制備

    將25mg鹽酸多巴胺,0.25g油酸和大豆磷脂1.0g溶于熱90%乙醇適量。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法,在氮?dú)饬髦谐掖?,至形成黏稠的溶液,加?%聚乙二醇400(PEG400)溶液,脂質(zhì)體自發(fā)形成。采用0. 01%NaOH調(diào)節(jié)上述脂質(zhì)體分散系pH至7.4,置高速勻漿機(jī)冰水中勻漿15分鐘,200nm微孔濾膜濾過, 即得多巴胺脂質(zhì)體。

    2.2 包封率的測(cè)定

    2.2.1 多巴胺HPLC分析條件

    報(bào)道,結(jié)合我們的儀器,多巴胺的HPLC分析條件如下:層析柱:SinoChrom ODS-BP5m,4.6mm×200mm;流動(dòng)相:磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀8.34 g與磷酸氫二鉀0.87g加水使溶解成1000m l,pH5.8)-甲醇(98∶2);檢測(cè)波長:280nm;流速:1.0 ml/ min。

    2.2.2 多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

    精密稱取多巴胺對(duì)照品,配制成多巴胺溶液,濃度分別為:20、40、80、160、320(g/mL)。在上述色譜條件下,采用HPLC測(cè)定各樣品峰面積,進(jìn)樣量50L。以各樣品濃度為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程:Y =17.814X -88.45, 結(jié)果表明在20-320 μg/mL范圍內(nèi)樣品濃度和峰面積呈線性關(guān)系(r =0. 9987)。

    2.2.3 包封率的測(cè)定

    采用絮凝分離法測(cè)定多巴胺脂質(zhì)體的包封率。精密量取多巴胺脂質(zhì)體0.25ml用15%NaCl和50mL容量瓶稀釋到50mL,靜置過夜,轉(zhuǎn)入10ml刻度試管5000rpm離心30分鐘,取下清液,按上述色譜條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定下清液中多巴胺濃度。按下述公式計(jì)算包封率:

    包封率(%)=1-(游離多巴胺濃度/多巴胺總濃度)×100%。

    2.2.4 粒度和Zeta 電位測(cè)定

    采用激光粒度/Zeta 電位分析儀,測(cè)定多巴胺脂質(zhì)體在蒸餾水中的粒度分布和Zeta電位。

    2.3 抗帕金森病作用

    2.3.1 小鼠帕金森氏病模型的制備

    取昆明種雌性小白鼠50只,體重18-22g,按體重差最小原則分成5組(10只/組):空白對(duì)照組,多巴胺對(duì)照,模型對(duì)照組,多巴胺組,多巴胺脂質(zhì)體組。除空白對(duì)照組和多巴胺對(duì)照,其它各組鼻腔給藥5天后,腹腔注射MPTP(20mg/kg)連續(xù)12天,同時(shí)繼續(xù)鼻腔給藥。空白對(duì)照,不給任何藥物。多巴胺組,鼻腔給藥,但是腹腔不注射MPTP。經(jīng)鼻給藥劑量為5μL/10g動(dòng)物。

    2.3.2 爬桿試驗(yàn)

    分別在在給予MPTP之后第6天和第10天,將小鼠置放于一根長50cm直徑1cm的木桿頂端,木桿上纏上紗布以防打滑,然后將受試小鼠放到桿頂,并記錄以下幾個(gè)時(shí)間:小鼠爬完桿長的全長所需要的時(shí)間;小鼠爬完桿長的上半部分所用的時(shí)間;小鼠爬完桿長下半部分所用的時(shí)間。將這3個(gè)時(shí)間相加作為本次被測(cè)小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)的總時(shí)間,并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    2.3.3 懸掛實(shí)驗(yàn)

    分別在在給予MPTP之后第6天和第10天,將受試小鼠雙前肢懸掛于一水平電線上,如小鼠用兩后肢抓住電線則記3分,如用一后肢抓住電線則記2分,如果小鼠兩后肢均抓不住電線則記1分,最后計(jì)算得分情況,并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次,采用Microsoft Office Excel計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差),利用t檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0. 05,定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 多巴胺納米脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥的小白鼠懸掛實(shí)驗(yàn)

    表2 多巴胺納米脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥的小白鼠爬桿實(shí)驗(yàn)

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 多巴胺脂質(zhì)體的理化性質(zhì)

    在蒸餾水中,多巴胺脂質(zhì)體的平均粒徑為20-120(nm), Zeta電位為-25.6 mV,對(duì)多巴胺的包封率為(98.2±1.6)%(n =3)。

    3.2 多巴胺納米脂質(zhì)體的抗帕金森氏病效應(yīng)

    經(jīng)鼻給藥,在爬桿實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)中,多巴胺納米脂質(zhì)體對(duì)MPTP引起的帕金森氏癥狀的對(duì)抗作用如表1-2所示。

    結(jié)果表明,多巴胺經(jīng)鼻給藥有一定的抗帕金森氏病作用,而且用脂質(zhì)體運(yùn)載多巴胺,可以顯著提高多巴胺的抗帕金森氏病作用。但是,尚不能使動(dòng)物恢復(fù)正常。

    4 討論

    本實(shí)驗(yàn)研究多巴胺脂質(zhì)體治療帕金森氏病的療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,多巴胺經(jīng)鼻給藥有一定的抗帕金森氏病作用,而且用脂質(zhì)體運(yùn)載多巴胺,可以顯著提高多巴胺的抗帕金森氏病作用。但是尚不能使動(dòng)物恢復(fù)正常。

    多巴胺難以通過血腦屏障,因此,目前帕金森氏病的治療無法采用多巴胺。增加血腦屏障通透性,有可能促進(jìn)多巴胺進(jìn)入中樞,但是破壞血腦屏障中樞神經(jīng)系統(tǒng)難以維持正常的功能。因此,要想采用多巴胺直接治療帕金森氏病,必須讓藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞。

    鞘內(nèi)注射和鼻粘膜給藥可以繞過血腦屏障[4]。鞘內(nèi)注射不方便,因此我們選擇了鼻粘膜給藥治療帕金森氏病。鼻腔給藥后藥物分子通過嗅粘膜,進(jìn)入腦脊液,可繞過血腦屏障的途徑。鼻粘膜壁薄,血管豐富,利于藥物滲和吸收。經(jīng)鼻給藥的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑包括嗅神經(jīng)通路,粘膜上皮通路(載體轉(zhuǎn)運(yùn),胞飲或被動(dòng)擴(kuò)散方式)以及細(xì)胞旁通路,即透過細(xì)胞間隙或周圍裂隙進(jìn)入細(xì)胞間液,從而轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腦脊液)。還有其它通路,如淋巴系統(tǒng),視神經(jīng),三叉神經(jīng)等。之前有報(bào)道,脂質(zhì)體能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)和肽類藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞[2]。本試驗(yàn)表明,脂質(zhì)體還能夠促進(jìn)其攜帶的小分子、極性強(qiáng)的藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞。多巴胺是攜帶正電荷的小分子極性很強(qiáng)的藥物,只能通過細(xì)胞旁路通道進(jìn)入腦脊液,吸收很有限。脂質(zhì)體攜帶多巴胺改變了電學(xué)性質(zhì),同時(shí)可以通過胞飲、穿過鼻粘膜或細(xì)胞旁路進(jìn)入腦脊液,不過其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

    5 結(jié)論

    多巴胺脂質(zhì)體能夠提高多巴胺經(jīng)鼻給藥治療帕金森氏病的療效,但是尚不能達(dá)到完全消除帕金森病癥狀的程度。脂質(zhì)體如何促進(jìn)多巴胺進(jìn)入中樞,以及如何提高多巴胺脂質(zhì)體抗帕金森氏病的療效尚待進(jìn)一步研究。

    參考文獻(xiàn)

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    R453

    A

    1674-2060(2016)02-0214-02

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