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    超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UFLC -MS/MS)測(cè)定山楂片中展青霉素含量的研究

    2016-10-27 03:47:01趙紅磊楊麗蓉趙紅艷
    生物技術(shù)世界 2016年2期
    關(guān)鍵詞:山楂片青霉素液相

    趙紅磊楊麗蓉趙紅艷

    (1.濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東濰坊 261201;2.濱州醫(yī)學(xué)院 山東煙臺(tái) 264003)

    超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(UFLC -MS/MS)測(cè)定山楂片中展青霉素含量的研究

    趙紅磊1楊麗蓉1趙紅艷2

    (1.濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東濰坊 261201;2.濱州醫(yī)學(xué)院 山東煙臺(tái) 264003)

    建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UFLC-MS/MS)測(cè)定山楂片中展青霉素含量的方法。山楂片樣品經(jīng)粉碎后酶解,以乙酸乙酯提取展青霉素,用HLB固相萃取小柱凈化并濃縮,以UFLC-MS/MS電噴霧離子源負(fù)離子(ESI-)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢驗(yàn)。方法線性相關(guān)系數(shù)0.9996,檢出限5μ g/kg,加標(biāo)回收率81.34~96.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.7%~4.6%。結(jié)果表明,方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,能應(yīng)用于山楂片中展青霉素含量的測(cè)定。

    超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 展青霉素 山楂片

    展青霉素(Patulin),化學(xué)名稱為4-羥基-4氫-呋喃-[3,2c]-吡喃-2(6)-酮[1],化學(xué)式C7H6O4,分子量154,屬雜環(huán)內(nèi)酮結(jié)構(gòu)。展青霉素首先在霉?fàn)€蘋果和蘋果汁中發(fā)現(xiàn),廣泛存在于各種霉變水果中。展青霉素是由曲霉和青霉等真菌產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物, 具有影響生育、致癌和免疫等毒理作用,同時(shí)也是一種神經(jīng)毒素。使人神經(jīng)麻痹、肺水腫、腎功能衰竭[2][3]。在食品檢驗(yàn)中,常在蘋果和山楂制品中發(fā)現(xiàn),是判斷該類產(chǎn)品是否安全的一個(gè)重要指標(biāo)[4]。

    鑒于展青霉素潛在的毒性及危害性,大多數(shù)國(guó)家和組織已建立了展青霉素的限量標(biāo)準(zhǔn),如歐盟規(guī)定蘋果汁及含蘋果汁的飲料中展青霉素最大限量為 50μg/kg,WHO 規(guī)定展青霉素在蘋果汁中的最高限量標(biāo)準(zhǔn)為 50μg/kg[5];我國(guó)對(duì)展青霉素的限量也作了規(guī)定,GB2761-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》規(guī)定以蘋果及山楂為原料制成的產(chǎn)品中(果丹皮除外)展青霉素限量為50μg/ kg。目前我國(guó)的展青霉素檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為薄層色譜法(GB/T5009.185-2003《蘋果和山楂制品中展青霉素的測(cè)定》)以及液相色譜法(NY/ T1650-2008《蘋果及山楂制品中展青霉素的測(cè)定高效液相色譜法》)兩種。薄層色譜法在實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中操作繁瑣,重復(fù)性差,液相色譜法則存在羥甲基糠醛的干擾,影響展青霉素的測(cè)定,存在假陽(yáng)性的可能。目前文獻(xiàn)報(bào)道中采用的檢測(cè)方法還有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫學(xué)檢測(cè)方法等[4,6]。本文在前人研究的基礎(chǔ)上,研究建立了山楂片及制品中展青霉素的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(液相為Shimadzu UFLCXR,質(zhì)譜為美國(guó)AB公司

    API4000+),分析天平 (XS205DU,梅特勒-托利多),食品粉碎機(jī)(屹立QE-100),渦旋混勻器 (IKA MS3 ),氮?dú)獯蹈蓛x(海能HN200),離心機(jī)(Thermo F16),pH計(jì)(梅特勒-托利多)。

    1.2 試劑及耗材

    乙腈、乙酸乙酯、冰乙酸(均為色譜純 ),果膠酶(Sigma公司),展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品(98.8%,Pribolab公司),Oasis HLB柱(3mL/60mg,美國(guó)Waters公司)、山楂制品樣品來(lái)自市場(chǎng)購(gòu)買。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    精密稱取適量展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中,用適量乙酸乙酯溶解后,加乙酸乙腈定容到刻度,配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,避光保存于-20℃冰箱中。準(zhǔn)確移取適量的展青霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于,氮?dú)獯蹈珊笥?.2%乙酸配制成1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,避光保存于4℃冰箱中。使用時(shí),根據(jù)需要以空白基質(zhì)溶液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液,標(biāo)準(zhǔn)使用溶液應(yīng)臨用前配制。

    1.4 樣品前處理

    1.4.1 提取

    確稱取5g均勻試樣(精確到0.01g) 于50mL具塞刻度試管中,加入20mL水與100μL果膠酶溶液,40℃避光放置2h酶解。在酶解后溶液中加入20mL乙酸乙酯,渦旋震蕩提取后,于6000rpm離心3min,轉(zhuǎn)移上層乙酸乙酯提取液,再用20mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次,收集兩次的乙酸乙酯溶液,40℃氮?dú)獯蹈珊?,用適量1%乙酸溶液溶解殘?jiān)?,并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中并定容,待下一步凈化處理。

    1.4.2 凈化

    Oasis HLB柱首先用6mL色譜甲醇和6mL水活化,然后準(zhǔn)確移取5.00mL上述樣品溶液(1.4.1)置于活化過(guò)的HLB柱內(nèi),使之以3mL/min的速度流過(guò)HLB柱,以乙酸乙酯洗脫,收集洗脫液并用氮?dú)獯蹈桑缓笥?.00mL 0.2%乙酸溶液溶解殘?jiān)?,過(guò)0.22μm濾膜后上機(jī)。

    1.5 試驗(yàn)方法

    1.5.1 液相色譜條件

    液相色譜柱1 (Shim-pack XR-ODS, 2.0×75mm,2.2μ m),液相色譜柱2(Shim-pack XR-ODS, 2.0×100mm,2.2μm),液相色譜柱3(BEHC18, 2.1×100mm,1.7μm)。流動(dòng)相:乙腈+水(10+90);流速:0.20mL/ min,柱溫:35℃。進(jìn)樣量:10μL。

    1.5.2 質(zhì)譜條件

    離子源:電噴霧離子源ESI;掃描方式:負(fù)離子模式;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM,利用保留時(shí)間和離子豐度判斷定性結(jié)果, 利用峰面積定量;噴霧電為-4500V;離子化溫度450℃;碰撞氣5;氣簾氣10;霧化氣13;輔助氣13;定量離子對(duì)m/z 152.8/108.8;定性離子對(duì)m/z 152.8/134.7;去簇電壓DP:-36;射入電壓EP:-6;碰撞電壓CE:-18;碰撞室射出電壓CXP:-15。

    圖1 展青霉素二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectrum of patulin

    表1 不同色譜柱對(duì)展青霉素的分離能力比較Table1 separation effects of patulin by different chromatography columns

    表2 精密度和準(zhǔn)確度考察結(jié)果Table2 Results of precision and accuracy

    圖2 50 μg/L展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品UFLC-MS/MS分離圖左圖為m/z108.8,右圖m/z134.7Fig.2 UFLC-MS/MS spectrum of patulin with concentration of 50 μg/L Left is m/z108.8, right is m/z108.8

    圖3 陽(yáng)性樣品中展青霉素UFLC-MS/MS分離圖左圖為m/z108.8,右圖m/z134.7Fig.3 UFLC-MS/MS spectrum of patulin in hawthorn tablets Left is m/z108.8, right is m/z108.8

    2 結(jié)果與討論

    2.1 質(zhì)譜條件的選擇

    根據(jù)展青霉素的性質(zhì),其具有較強(qiáng)的電負(fù)性,因此在負(fù)離子模式下,對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。采用針泵進(jìn)樣的方式對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。首先用針泵進(jìn)樣1μg/mL展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,流速10μL/min,找準(zhǔn)其母離子m/z 152.8,調(diào)整CE電壓使母離子峰高約為最大子離子峰高的1/3至1/4,同時(shí)確定其子離子碎片m/z 108.8、m/z 134. 7,以m/z 152.8/108.8為定量離子對(duì),以m/z 152.8/134.7作為定性離子對(duì)(見(jiàn)圖1)。

    2.2 色譜條件的選擇

    展青霉素屬于強(qiáng)極性化合物,同時(shí)其分子量較低,因此本試驗(yàn)采用常用的C18柱對(duì)展青霉素進(jìn)行分離,分別考察了不同C18柱Proshell 120 SB-C18、Inertsil ODS-3、BEH C18分離能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同C18柱分離效果都能達(dá)到要求,出峰時(shí)間有所差別,綜合選擇了出峰時(shí)間較晚,峰寬最窄的Inertsil ODS-3色譜柱。

    由于展青霉素的強(qiáng)極性,為了保證較好的分離洗脫,因此試驗(yàn)選擇極性較低的乙腈作為流動(dòng)相,同時(shí)將乙腈的比例設(shè)置為較低比例10%,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該條件對(duì)展青霉素的分離有較好的效果。同時(shí)由于展青霉素在酸性條件下較為穩(wěn)定,因此本試驗(yàn)選擇0.2%乙酸溶液為溶劑對(duì)樣品進(jìn)行定容。

    2.3 靈敏度和檢出限

    試驗(yàn)對(duì)該方法的靈敏度和檢出限進(jìn)行了考察,靈敏度以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程考察。用空白樣品處理液稀釋展青霉素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,得到濃度為10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列,以峰面積為Y軸、濃度為X軸進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=151.5x-55.7,r2=0.9996,線性相關(guān)性良好。

    取空白樣品處理液添加適當(dāng)濃度展青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)樣,按3倍信噪比S/N計(jì)算得出其最低檢測(cè)限為5μg/kg,而我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的展青霉素的限量為50μg/kg,此方法完全能滿足需要。

    2.4 精密度和準(zhǔn)確度

    取不含展青霉素的空白樣品進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),分別添加至10μg/ kg、30μg/kg、50μg/kg三個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn),以回收率考察方法的準(zhǔn)確度,同時(shí)每個(gè)水平進(jìn)6針作平行測(cè)定,以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)考察方法的精密度。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表。

    2.5 實(shí)際樣品測(cè)試

    根據(jù)本文確定的試驗(yàn)方法,我們從市場(chǎng)上購(gòu)買了10份山楂片樣品進(jìn)行檢測(cè),其中有一份樣品檢出陽(yáng)性,檢出展青霉素含量為13.2 μg/kg。陽(yáng)性樣品色譜圖見(jiàn)圖。

    3 結(jié)果和討論

    本文通過(guò)開(kāi)展系列試驗(yàn)研究,考察了不同色譜柱對(duì)展青霉素的分離能力,通過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜條件,確定了展青霉素的定性和定量離子對(duì),從而能對(duì)展青霉素進(jìn)行確證性檢測(cè),考察了方法的靈敏度、檢出限、精密度和準(zhǔn)確度,同時(shí)對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果表明該方法能夠快捷準(zhǔn)確的對(duì)山楂片中的展青霉素進(jìn)行檢測(cè),能較好的滿足檢驗(yàn)需求。

    [1]徐明悅,李洪軍,王珊等.食品中展青霉素檢測(cè)方法及脫除技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2015,36(01):375-380.

    [2]周克權(quán).展青霉素的化學(xué)檢測(cè)方法[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2001,28(1):29-32.

    [3]周玉春等.展青霉素的研究進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(2):112-116.

    [4]劉功良,陶嫦立,白衛(wèi)東,趙文紅.農(nóng)產(chǎn)品中展青霉素檢測(cè)的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(10):6084-6092.

    [5]毛艷玲,蔡艷等.蘋果中展青霉素的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2015,29(9):1757-1765.

    [6]王婭芳,劉利亞,黃培林.展青霉素檢測(cè)方法及污染情況的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,39(19):5116-5223.

    Research of content determination of patulin in haw flakes by UFLC-MS/MS

    Honglei Zhao1, Lirong Yang1, Hongyan Zhao2
    (1 Weifang Center for Food and Drug Control, Weifang 261201, China)(2 Binzhou Medical University, Yantai264003, China)

    A method was developed for content determination of patulin in haw flakes by UFLC-MS/MS. Haw flakes samples were enzymed after crushed,then patulin was extracted by ethyl acetate, purified by HLB solid-phase extraction column, and determined by UFLC-MS/MS with electrospray negative ionization (ESI-) in multiple reaction monitoring (MRM). Good Linear correlation coefficient 0.9996 was observed. Detection limit of the method was 5μ g/kg. The recovery rate of patulin added was 81.34% ~ 96.4% with the relative standard deviation from 1.7% to 4.6%. The results showed that the method is simple,fast and accurate, and could be applied on content determination of patulin in the hawthorn tablets.

    UFLC-MS/MS; patulin; haw flakes

    R917

    A

    1674-2060(2016)02-0016-03

    趙紅磊(1985-),男,工程師,主要從事食品檢驗(yàn)方面的研究。

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