青霉素結(jié)合蛋白PBP 2b基因的克隆與表達(dá)

覃鴻妮 俞蘇敏

（蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院 江蘇蘇州 215123）

青霉素結(jié)合蛋白PBP 2b基因的克隆與表達(dá)

覃鴻妮 俞蘇敏1

（蘇州工業(yè)園區(qū)服務(wù)外包職業(yè)學(xué)院 江蘇蘇州 215123）

在已知基因序列但缺乏DNA模版的情況下，人工設(shè)計(jì)合成多條引物，采用重疊PCR技術(shù)體外人工合成編碼青霉素結(jié)合蛋白的基因PBP 2b。將合成的PBP 2b基因連接到載體pet-30a上，并將重組表達(dá)載體（pet-30a）/PBP2b-tiger轉(zhuǎn)入T7 expression E.coli表達(dá)菌株中。重組工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，用SDS-PAGE鑒定，發(fā)現(xiàn)青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）成功表達(dá)。本研究構(gòu)建了高表達(dá)青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）的原核表達(dá)系統(tǒng)，制備出青霉素結(jié)合蛋白，從而為進(jìn)一步從基因水平認(rèn)識(shí)青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）奠定基礎(chǔ)，為了解細(xì)菌耐藥的機(jī)制提供依據(jù)。

青霉素結(jié)合蛋白 PBP 2b基因 克隆 表達(dá)

青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins， PBPs） 是細(xì)菌表面的一種微小蛋白質(zhì)，PBPs由Suginaka 等于1972年第一次報(bào)道，能和青霉素共價(jià)結(jié)合，使青霉素具有完全的抗原性［1］。PBPs是一類在肽聚糖合成中起著重要作用酶類，當(dāng)外源青霉素或其它β-內(nèi)酰胺類抗生素作為青霉素結(jié)合蛋白底物（細(xì)胞正常代謝過程中，本應(yīng)與青霉素結(jié)合蛋白反應(yīng)結(jié)合的物質(zhì)）的結(jié)構(gòu)類似物，競爭性地與青霉素結(jié)合蛋白共價(jià)結(jié)合，就可以引起細(xì)菌細(xì)胞壁合成相關(guān)酶的缺乏，從而干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，以達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用［2］。一旦青霉素結(jié)合蛋白的數(shù)量、種類或者與抗生素的親和力發(fā)生變化將會(huì)影響細(xì)菌的形態(tài)或細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性。細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白改變引起的細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性是現(xiàn)研究的熱點(diǎn)之一，其對(duì)抗生素的改造、新抗生素的設(shè)計(jì)均有指導(dǎo)意義［3，4，5，6］。肺炎鏈球菌能引起肺炎、腦膜炎、中耳炎及敗血癥等多種疾病，是常見細(xì)菌性感染的主要病原菌之一，多年來一直是人類健康的大敵，也是科學(xué)家研究的焦點(diǎn)之一。PBP 2b基因是肺炎鏈球菌中已發(fā)現(xiàn)的5個(gè)編碼明確的青霉素結(jié)合蛋白的基因之一［7］，其表達(dá)蛋白為青霉素結(jié)合蛋白2b，基因編號(hào)為spr1517。本研究著重于編碼肺炎鏈球菌PBPs的其中一個(gè)基因PBP 2b的克隆及表達(dá)，為的是更深層次的了解青霉素結(jié)合蛋白相關(guān)基因的表達(dá)機(jī)制，以便為進(jìn)一步深入研究青霉素結(jié)合蛋白奠定基礎(chǔ)，為了解細(xì)菌耐藥的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 目的基因

在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢Sundick等發(fā)表的肺炎鏈球菌的PBP 2b 基因的序列，根據(jù)其基因序列，利用PAS技術(shù)合成該基因即為本研究的目的基因。

1.1.2 受體菌TOP10、T7 expression E.coli ；載體 pet30a。

1.2 方法

根據(jù)基因序列委托相關(guān)公司設(shè)計(jì)和合成PCR擴(kuò)增所需PBP 2b的引物，將引物稀釋到20pmol/uL，每條引物取2uL混勻作為引物混液。通過兩輪PCR擴(kuò)增目的基因。第一輪PCR引物拼接獲得目的基因，第二輪PCR（基因擴(kuò)增），在第一輪PCR以后， 以擴(kuò)增的產(chǎn)物為模版，用片段兩端的引物進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的基因.

1.2.2 目的基因克隆

（1）目的基因與載體雙酶切后連接

用BamHI與XhoI酶切來獲得目的基因PBP 2b，同時(shí)用BamHI與XhoI酶切載體pGEM-T。酶切后將目的基因與載體連接。

（2）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取一管-80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞（100μl），置冰上融化；加入連接產(chǎn)物pGEM-T/PBP 2b（10μl），輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻，冰浴30min；將1.5EP管置于42℃熱擊100s，然后迅速置冰浴3分鐘；向管中加入800uL LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)30min（目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇）；

將1.5EP管5000r離心5min，析出部分培養(yǎng)液，棄之，吸取前吹打一下，把約100ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到LB體瓊脂培養(yǎng)基上（含50ug/ml Amp，內(nèi)已倒入若干無菌的玻璃珠），把平板輕輕地上下左右均勻搖晃，使得無菌的玻璃珠將細(xì)胞均勻涂開；將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)，至藍(lán)白斑生長區(qū)分明顯為止。

圖1 目的基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 pGEM-T/PBP 2b 酶切電泳圖

1.2.3 陽性克隆的PCR鑒定

隨著生產(chǎn)力的發(fā)展，奴隸主土地的開墾面積越來越大，從前的“井田制”遭到破壞，許多奴隸主一方面使用奴隸開墾公田同時(shí)又大量招收“隱民”、“私屬徒”進(jìn)行開荒，擴(kuò)大自己的私田面積。有些貴族為了增加自己的收入大量開發(fā)荒蕪的上地，就成為擁有大量私田的地主。另一方面，從事大規(guī)模集體生產(chǎn)的奴隸，由于不堪忍受奴隸主的殘酷剝削和壓迫，則紛紛選擇逃亡，這樣就使井田逐漸荒蕪。井田制的破壞，就說明奴隸制社會(huì)的經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)開始崩潰。私田的不斷增多，促進(jìn)了封建生產(chǎn)關(guān)系的產(chǎn)生和新興地主階級(jí)勢力的發(fā)展，最終打破了奴隸社會(huì)“工商食官”社會(huì)分工體系。

陽性克隆的驗(yàn)證通過隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化平板上的陽性單菌落，接種于2mL LB培養(yǎng)基（50μg/ml Amp）中，37℃ 8h 220r振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒對(duì)其目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)而多擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將pGEM-T/PBP 2b質(zhì)粒用BamHI和XhoI酶切后通過瓊脂糖電泳來驗(yàn)證目的基因并獲得目的基因。用移液槍吸取6 μl的菌檢PCR產(chǎn)物點(diǎn)入濃度為1%的檢測膠，電泳儀220V、280mA電泳7min。

1.2.4 蛋白表達(dá)

（1）將正確克?。╬et-30a）/PBP2b-tiger轉(zhuǎn)入T7 expression E. coli（NEB菌株），菌液涂布于同時(shí)含Amp和Kan的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜。

（2）取2克隆分別加入含4 m l L B的試管中，3 7°C培養(yǎng)至OD600=0.6 ，取一試管中加入4μl，濃度為1M的IPTG誘導(dǎo)劑，使終濃度為1mM，另一試管不加誘導(dǎo)劑作為陰性對(duì)照。再繼續(xù)培養(yǎng)3h，各吸取500μl菌液離心，棄上清。每管加入50μl 50mM，pH8.0的Tris-Hcl?；靹蚝?，沸水煮10min，離心取上清液，采用SDS-PAGE法鑒定表達(dá)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的合成

目的基因的電泳檢測結(jié)果如圖1所示，PBP2b的PCR產(chǎn)物條帶大小在2000bp左右，與其理論值大小2262bp相符，可判斷PCR產(chǎn)物正確。

2.2 pGEM-T/PBP 2b 酶切結(jié)果

將pGEM-T/PBP 2b質(zhì)粒用BamHI和XhoI酶切后通過瓊脂糖電泳來驗(yàn)證目的基因并獲得目的基因。通過電泳圖2可表明上帶大小為3 0 0 0 b p左右，下帶在2 2 0 0 b p左右；與克隆載體p G E M-T 3100bp、目的基因PBP 2b 2262bp的大小相吻合。

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

將酶切下的目的基因PBP 2b連接到表達(dá)載體（pet-30a），用BamHI和XhoI酶切后通過瓊脂糖電泳來驗(yàn)證目的基因是否導(dǎo)入。通過電泳圖3可表明上帶大小為5000 bp左右，下帶在2200bp左右；與表達(dá)載體（pet-30a）5300bp、目的基因PBP 2b 2262bp的大小相吻合，可判定表達(dá)載體構(gòu)建正確。

2.4 PBP 2b所表達(dá)的蛋白檢測

通過不同濃度的IPTG來誘導(dǎo)PBP 2b，SDS-PAGE凝膠電泳來檢測蛋白，從圖4可知用0.3mmol/L、0.6mmol/L、0.9mmol/L 濃度的IPTG誘導(dǎo)出的蛋白大小約為87KD左右，與PBP 2b應(yīng)表達(dá)蛋白大小相吻合，但表達(dá)強(qiáng)度不同，可判斷IPTG的濃度對(duì)于PBP 2b蛋白表達(dá)強(qiáng)度有一定影響。

圖3 表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證

圖4 PBP 2b蛋白表達(dá)檢測

3 結(jié)論與討論

3.1 青霉素結(jié)合蛋白PBP 2b基因的克隆

本研究運(yùn)用PCR法獲得PBP 2b基因，將連接到切成指定的克隆載體上；在PCR過程中產(chǎn)物兩端加入BamHI和XhoI的酶切位點(diǎn)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理連接至表達(dá)載體，運(yùn)用轉(zhuǎn)化表達(dá)載體成功獲得PBP 2b的克隆。

3.2 青霉素結(jié)合蛋白PBP 2b基因的表達(dá)

通過誘導(dǎo)劑IPTG的不同濃度來誘導(dǎo)PBP 2b蛋白，結(jié)果表明IPTG的濃度直接關(guān)系到重組蛋白的表達(dá)水平，本研究結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)E.coli BL21蛋白表達(dá)濃度在1 mmol/L以內(nèi)時(shí)，其濃度越高誘導(dǎo)效果越好，但因IPTG既能誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)外源蛋白質(zhì)又同時(shí)對(duì)大腸桿菌有一定的毒害作用，故本研究沒有設(shè)置高于1mmol/L的誘導(dǎo)濃度。

PBPs譜變異與細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生密不可分，本研究結(jié)果也為更深層次了解青霉素結(jié)合蛋白提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為了解細(xì)菌耐藥性奠定基礎(chǔ)。

［1］朱竟赫，郭文潔，劉耀川等.革蘭陽性菌青霉素結(jié)合蛋白研究進(jìn)展［J］，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（1）：77-80.

［2］熊亞莉，青霉素結(jié)合蛋白研究進(jìn)展［J］，國外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2004，25（5）：193-197.

［3］向華國，王曉紅，熊札寬，李凌云，潘鵬，朱德保，梅毒螺旋體青霉素結(jié)合蛋白的克隆及表達(dá)［J］，中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（5）：723-724，727.

［4］陳婉純.呼吸道細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性與合理使用抗生素［J］，中國醫(yī)藥指南，2013，11（21）：266-267.

［5］綦廷娜，王和，陳崢宏.細(xì)胞壁缺陷肺炎鏈球菌青霉素結(jié)合蛋白2b基因片段的檢測［J］，2010，36（5）：552-553.

［6］孔聰聰，劉改芳.幽門螺桿菌對(duì)抗生素耐藥的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］，2014，29（4）：478-480.

［7］袁竹青，吳忠道，肺炎鏈球菌R6株全基因組序列的初步分析［J］，中國人獸共患病雜志2003，19（6）：93-97.

Q75

A

1674-2060（2016）02-0011-02

覃鴻妮（1983—），女，湖北長陽人，博士，講師，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。