• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    丁草胺降解菌的分離優(yōu)化

    2016-10-27 03:46:59國(guó)增超
    生物技術(shù)世界 2016年2期
    關(guān)鍵詞:草胺革蘭氏培養(yǎng)箱

    國(guó)增超

    (齊魯醫(yī)藥學(xué)院生化教研室 山東淄博 255213)

    丁草胺降解菌的分離優(yōu)化

    國(guó)增超

    (齊魯醫(yī)藥學(xué)院生化教研室 山東淄博 255213)

    通過(guò)富集、馴化培養(yǎng)及平板劃線(xiàn)等微生物分離技術(shù),從長(zhǎng)期生產(chǎn)丁草胺的山東省某農(nóng)藥廠(chǎng)附近的土壤中分離得到了三株以丁草胺為唯一碳源或氮源的降解菌株,分別標(biāo)記為SD-1、SD-2和SD-3。通過(guò)革蘭氏染色可以判斷,SD-1被染成藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性球菌,SD-2被染成藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性桿菌,SD-3被染成紅色為革蘭氏陰性桿菌.隨后,通過(guò)糖發(fā)酵及IMVIC等生理生化實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株的基本生理生化特征進(jìn)行了鑒定.同時(shí),通過(guò)單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了三株丁草胺降解菌的最適生長(zhǎng)溫度均為28℃,最適pH均為7.0,所需的最適丁草胺濃度SD-1為100 mmol/L,SD-2和SD-3均為300 mmol/L.

    丁草胺 生物降解 富集 分離

    丁草胺是一種高效內(nèi)吸傳導(dǎo)型苯乙酰胺類(lèi)除草劑,尤其是對(duì)禾本科雜草有較好的除草效果,因其具有殺草活性高、選擇性強(qiáng)、用量少等優(yōu)點(diǎn),丁草胺及其復(fù)配制劑每年均大量生產(chǎn),已逐步成為我國(guó)用量最大的除草劑之一[1]。

    但是丁草胺在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的同時(shí),不可避免的在植株、土壤和水體等系統(tǒng)中殘留,對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。其不僅對(duì)光合細(xì)菌、固氮細(xì)菌等微生物的生長(zhǎng)有抑制作用[2-3],破壞了生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn),而且嚴(yán)重影響了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量和人們的身體健康。陳小軍[4]等針對(duì)丁草胺在水稻上的降解動(dòng)態(tài)與殘留情況進(jìn)行了分析研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在水稻田以常規(guī)劑量2.571g/hm2和高劑量3.857g/ hm2施用35%丁·芐可濕性粉劑后,水稻植株中的殘留量為0.1738~0.2230mg/kg,在稻米中的殘留量為0。0154~0.0342 mg/kg,在米糠中的殘留量為0.0107~0.0297mg/kg。雖然檢測(cè)中的丁草胺含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),但是隨著丁草胺用量的日益擴(kuò)大,丁草胺在生態(tài)環(huán)境中的安全問(wèn)題逐漸引起了人們的關(guān)注[5-10]。

    土壤和水環(huán)境中的丁草胺可以通過(guò)光解的方式進(jìn)行降解。但是,有研究表明,丁草胺抗光解的性能比較好[11],并且其在土壤中的光解速率和深度隨土壤和水體pH值的增大而加快[6],這樣在對(duì)丁草胺進(jìn)行降解的同時(shí),也破壞了水體和土壤的酸堿平衡。與光解相比,微生物代謝在除草劑降解中具有投資少、處理效率高、運(yùn)行成本低、無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì)。因此,針對(duì)殘留丁草胺的處理降解目前主要集中在微生物降解研究上。趙淑莉等[13]用高效液相色譜對(duì)除草劑丁草胺在水溶液中的微生物降解進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,接種微生物后丁草胺的降解速率明顯加快,說(shuō)明微生物是丁草胺降解的主要因素。李春艷等[14]用富集培養(yǎng)技術(shù)從長(zhǎng)期施用丁草胺的稻田土壤中分離得到1株能夠降解丁草胺的細(xì)菌,并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,可使丁草胺降解率達(dá)90.85%以上。

    本研究以長(zhǎng)期生產(chǎn)丁草胺的山東省某農(nóng)藥生產(chǎn)廠(chǎng)附近的污水及土壤為材料,對(duì)丁草胺降解菌進(jìn)行了分離優(yōu)化,并對(duì)其生理生化特征進(jìn)行了初步研究,擬在為丁草胺的降解提供優(yōu)良菌株資源,對(duì)丁草胺污染土壤的生物修復(fù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

    表1 革蘭氏染色結(jié)果Table 1 Gram stain results

    表2 生理生化特征Table 2 characteristics of physiological and biochemical

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    從生產(chǎn)丁草胺的山東省某農(nóng)藥廠(chǎng)附近采集的土壤作為樣品。

    土壤的理化性質(zhì):堿性,有刺激性氣味,顆粒狀黑色,溶于水后分上、中、下三層。

    1.2 培養(yǎng)基

    富集培養(yǎng)基:蛋白胨1.0g,葡萄糖5.0g,K2HPO4 1.0g,KH2PO4 1.0g,NaCl 2.5g,加去離子水至1000ml,pH調(diào)至7.0,121℃,滅菌30min。

    無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基:MgSO4 0.5g,F(xiàn)eSO4 0.018g,K2HPO4 1. 31g,NaNO3 3.0g,

    KCL 0.5g,加去離子水至1000ml,pH調(diào)至7。0,121℃,滅菌30min。

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏5.0g,蛋白胨1.0g,瓊脂粉20g,NaCl 2.5g,

    加去離子水至1000ml,pH調(diào)至7.2,121℃,滅菌30min。

    糖發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨2.0g,葡萄糖10。0g,溴百里酚藍(lán)3ml,NaCl 5.0g

    K2HPO4 0.2g,加去離子水至1000ml,pH調(diào)至7.2,121℃,滅菌30min。

    蛋白胨水培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0g,pH調(diào)至7.4,121℃,滅菌30min。

    葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基:葡萄糖10.0g,蛋白胨10.0g,加去離子水至1000ml,pH調(diào)至7.2,121℃,滅菌30min。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 菌株的富集與分離

    取10g土樣溶于1000ml蒸餾水中,混勻,從上、中、下三層各取10ml樣品分別接入100ml的富集培養(yǎng)基中。在28℃下?lián)u床培養(yǎng)4d左右后取出,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基變渾濁,再將上述培養(yǎng)液各取10ml加入到含有丁草胺的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,在28℃下?lián)u床培養(yǎng),然后每隔7天接入新鮮的含丁草胺的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基并逐步提高丁草胺的濃度,如此進(jìn)行馴化富集培養(yǎng)約2個(gè)月。然后分別取培養(yǎng)液接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,挑取生長(zhǎng)較好的菌落回接于含有丁草胺的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,待溶液出現(xiàn)渾濁,接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng),待出現(xiàn)菌落后,各挑取一株生長(zhǎng)速度快,比較大的菌落進(jìn)行劃線(xiàn)分離,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    表3 pH對(duì)丁草胺降解菌的影響Table 3 the impact of pH

    表4 溫度對(duì)丁草胺降解菌的影響Table 4 the impact of temperature

    表5 丁草胺濃度對(duì)丁草胺降解菌的影響Table 5 the impact of butachlor concentration

    1.3.2 革蘭氏染色

    對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色,其中染成紅色的為革蘭氏陰性菌,染成藍(lán)紫色的為陽(yáng)性菌,在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。

    1.3.3 純化菌株的生理生化特征鑒定[15]

    糖發(fā)酵試驗(yàn)

    此實(shí)驗(yàn)利用細(xì)菌分解糖的產(chǎn)物不同進(jìn)行菌株的鑒定。有的細(xì)菌分解糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,有的細(xì)菌分解糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

    將分離純化的三株丁草胺降解菌分別接種于含有糖發(fā)酵培養(yǎng)基的三只試管中,再取一個(gè)只含有糖發(fā)酵培養(yǎng)基而不接種任何菌株的試管和一個(gè)已接種了大腸桿菌且含有糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管分別作為對(duì)照和比較,在上述試管中分別放入一個(gè)裝滿(mǎn)培養(yǎng)液的小試管。將上述裝置放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d,觀(guān)察并記錄結(jié)果。

    吲哚試驗(yàn)

    含有色氨酸酶的細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚,吲哚與對(duì)二甲基苯甲醛結(jié)合形成紅色化合物。

    將分離純化的三株丁草胺降解菌分別接種于含有蛋白胨水培養(yǎng)基的三只試管中,再取一個(gè)只含有蛋白胨水培養(yǎng)基而不接種任何菌株的試管和一個(gè)已接種了大腸桿菌且含有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管分別作為對(duì)照和比較。將上述裝置放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d,取出后加入乙醚并充分振蕩,使吲哚溶于乙醚中,然后慢慢加入吲哚試劑5滴,觀(guān)察有無(wú)玫瑰紅色出現(xiàn)。

    伏普試驗(yàn)

    有些細(xì)菌可利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸脫羧變成乙酰甲基甲醇,此物再堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰,二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成紅色化合物。

    將分離純化的三株丁草胺降解菌分別接種于含有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的三只試管中,再取一個(gè)只含有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基而不接種任何菌株的試管和一個(gè)已接種了大腸桿菌且含有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管分別作為對(duì)照和比較。將上述裝置放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。

    1.3.4 單因子優(yōu)化試驗(yàn)測(cè)丁草胺降解菌的最適生長(zhǎng)條件

    pH對(duì)丁草胺降解菌的影響

    將三株丁草胺降解菌等量稀釋并接種于pH分別為6,7,8,9,丁草胺濃度為100mmol/L的選擇培養(yǎng)基中,在28℃震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d,然后分別去1ml培養(yǎng)液稀釋10倍后,取1ml稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。計(jì)算各培養(yǎng)皿中單菌落數(shù)。

    溫度對(duì)丁草胺降解菌的影響

    將三株丁草胺降解菌等量稀釋并接種于pH為7,丁草胺濃度為100mmol/L的選擇培養(yǎng)基中,分別在15℃、20℃、28℃、33℃的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d,然后分別取1ml培養(yǎng)液稀釋10倍后,取1ml稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。計(jì)算各培養(yǎng)皿中單菌落數(shù)。

    丁草胺濃度對(duì)其降解菌生長(zhǎng)的影響

    將三株丁草胺降解菌等量稀釋并接種于pH為7,丁草胺濃度分別為50 mmol/L 、100mmol/L、300mmol/L、500mmol/L的液體培養(yǎng)基中,分別在20℃、28℃、33℃的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d,然后分別取1ml培養(yǎng)液稀釋10倍后,取1ml稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。計(jì)算各培養(yǎng)皿中單菌落數(shù)。

    2 結(jié)果及分析

    2.1 革蘭氏染色

    經(jīng)過(guò)多次分離純化,得到三株以丁草胺為唯一碳源或氮源生長(zhǎng)的菌株,分別標(biāo)記為SD-1、SD-2、SD-3。革蘭氏染色后的結(jié)果如表1所示。SD-1被染成藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性球菌,SD-2被染成藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性桿菌,SD-3被染成紅色為革蘭氏陰性桿菌。

    2.2 生理生化特征鑒定

    本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離純化的三株菌株的生理生化特征進(jìn)行了鑒定,結(jié)果如表2所示。由實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可知,三株菌株都能利用葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,但是丙酮酸的去路不同。SD-1和SD-3分解葡萄糖產(chǎn)生的丙酮酸通過(guò)脫羧、氧化生成了二乙酰,二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成紅色化合物;而SD-2分解葡萄糖產(chǎn)生的丙酮酸又進(jìn)一步分解成了甲酸。由吲哚試驗(yàn)可知,SD-1不含色氨酸酶,SD-2與SD-3兩株菌株含色氨酸酶。

    2。3 不同因素對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

    微生物降解農(nóng)藥的能力與溫度、pH以及農(nóng)藥的濃度都有一定的關(guān)系。因此,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)底物濃度、溫度以及pH對(duì)菌株的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,在溫度及底物濃度都恒定的條件下,當(dāng)pH=7時(shí),三株菌株的數(shù)量最多,生長(zhǎng)最快(表3)。說(shuō)明中性條件是降解菌的最適生長(zhǎng)條件。在pH、底物濃度等都相同的條件下,菌株數(shù)目雖溫度的升高,呈現(xiàn)出先增多后減少的趨勢(shì),并且當(dāng)溫度為28℃時(shí),菌株數(shù)目最多(表4)。因此,降解菌最適宜的生長(zhǎng)溫度在28℃左右。進(jìn)一步對(duì)底物濃度的研究發(fā)現(xiàn)(表5),當(dāng)丁草胺的濃度為100mmol/L時(shí),SD-1的數(shù)量最多,生長(zhǎng)最快;當(dāng)丁草胺的濃度升高為300mmol/L時(shí),SD-2和 SD-3的數(shù)量最多。但當(dāng)丁草胺濃度繼續(xù)升高時(shí),三株菌的數(shù)量均呈下降趨勢(shì)。

    3 結(jié)論

    丁草胺因其殺草活性高,選擇性強(qiáng)等特點(diǎn),已逐漸成為我國(guó)用量最多的三大除草劑之一[16]。目前,國(guó)外所報(bào)告的對(duì)丁草胺有降解作用的微生物主要有毛霉菌屬、毛殼球菌、青霉菌屬等[18],但我國(guó)關(guān)于丁草胺降解菌的報(bào)道較少,主要有節(jié)桿菌屬等[8]。本研究通過(guò)富集、馴化培養(yǎng)等微生物分離技術(shù),從長(zhǎng)期生產(chǎn)丁草胺的山東省某農(nóng)藥廠(chǎng)附近的土壤中分離得到了三株以丁草胺為唯一碳源或氮源的降解菌株。通常情況下,微生物降解農(nóng)藥的能力與濃度、pH及溫度等都有一定的關(guān)系,在自然環(huán)境中的降解能力還會(huì)受到其他微生物的影響。本研究通過(guò)單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)三株丁草胺降解菌所需的最適丁草胺濃度、最適pH及最適溫度等進(jìn)行了確定。中性條件以及溫度在28℃左右時(shí),三株降解菌的生長(zhǎng)力最強(qiáng);SD-1最適宜生長(zhǎng)的丁草胺濃度為100mmol/L,而SD-2和 SD-3最適宜的丁草胺濃度為300mmol/L,但當(dāng)丁草胺濃度繼續(xù)升高時(shí),三株菌的數(shù)量均呈下降趨勢(shì)。

    本研究所進(jìn)行的單因子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)等操作是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的,菌株是否能夠在田間自然環(huán)境下對(duì)土壤中的丁草胺進(jìn)行降解以及降解率如何則需要將菌株接種到污染土壤中實(shí)際測(cè)定其修復(fù)能力[19-21]。另外,后續(xù)研究還將進(jìn)一步對(duì)菌株的16srRNA基因序列進(jìn)行分析,以準(zhǔn)確確定菌株所屬種屬,并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行降解率的研究。

    [1]吳新杰,岳永德,花日茂,等.丁草胺高效降解細(xì)菌的分離[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2000,6(6):593-596.

    [2]Zager M Y. Effects of benthiocarb and butachlor on growth and nitrogen fixation by cyanobacteria [J].Bull Environ Contam Toxicol, 1990, 45(2):232-234.

    [3]Lee K M. Effects of butachlor on the growth of purplenon sulfur bacteria[J]. Misaengmul Hakhoechi,1991,29(2):130-135.

    [4]陳小軍,程?hào)|美,徐漢虹,等.丁草胺在水稻上的降解動(dòng)態(tài)與殘留分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,28(3):286-290.

    [5]馮慧敏,何紅波,武葉葉,等.黑土環(huán)境中乙草胺的微生物降解特征研究[J].土壤通報(bào),2008,39(2):379-343.

    [6]鄭和輝,葉常明.甲草胺和丁草胺等除草劑在多介質(zhì)環(huán)境中環(huán)境行為綜述[J].環(huán)境科學(xué)進(jìn)展,1999,7(3):1-10.

    [7]李川,古國(guó)榜,柳松.丁草胺高效真菌的分離及性能研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2004,23(3):611-614.

    [8]田芹,周志強(qiáng),江樹(shù)人,等.丁草胺在環(huán)境中降解行為的研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥,2004,43(5):205-208.

    [9] Zheng H, Ye C. Photodegration of acetochlor and butachlor in waters containing humic acid and inorganic ion [J]. Bull Environ ContamToxicol, 2001, 67: 601-608.

    [10] Yu Y L, Chen Y X, Luo Y M. Rapid degradation of butachlor in wheat rhizosphere soil [J]. Chemosphere, 2003, 50: 771-774.

    [11]楚小強(qiáng),龐國(guó)輝,方華,等.丁草胺降解菌的分離鑒定及降解特性的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2009,28(1):145-150.

    [12]趙淑莉,譚文捷,何緒文.除草劑丁草胺的分析測(cè)定及其微生物降解產(chǎn)物研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2005,24(5):989-993.

    [13]李春艷,李艷春,成小松,等.一株丁草胺降解菌的分離鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2010,30(2):347-353.

    [14]東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:267-273.

    [15]胡笑形.我國(guó)農(nóng)藥工業(yè)的現(xiàn)狀與發(fā)展方向[J].農(nóng)藥,1998,37(6):7-10.

    [16]Cheng H R, Jiang N. Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts[J]. Biotechnology Letters, 2006, 28: 55-59.

    [17]Karen M K, Sherry L H, Douglas C N. Novel, attached, sulfuroxidizing bacteria at shallow hydrothermal ventspossess vacuoles not involved in respiratory nitrate accu-mulation[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70: 7487-7496.

    [18]Hsu K Y, Lin H J, Lin J K, et al. Mutagenicity study of butachlor and its metabolites using salmonella typhimurium[J]. Microbiol Immunol Infect, 2005, 38(6): 409-416.

    [19]Beestman G B, Deming J M. Dissipation of acetanilide herbicides fromsoils [J]. Agronomy Journal, 1974,66(2):308-311.

    Isolation and optimization of Butachlor Degradation Bacteria

    GUO Zeng-chao
    (Department of Biochemistry, Qilu Medical University, Zibo, Shandong, 255213)

    Three butachlor-degrading strains named SD-1, SD-2 and SD-3 were isolated from the soil samples that obtained from the pesticide factory by enrichment culture, domestication selection and plate streaking. SD-1and SD-2 were dyed blueviolet, while the SD-3 was dyed red by the Gram stain. According to the Carbohydrate and IMVIC experiment, the morphologic and physiobiochemical characteristics of the bacteria were identified. Then, by the single factor optimize experiment, the optimal temperature of the three strains were 28℃ and the optimal pH were 7, the optimal butachlor density of the SD-1 was 100mmol/ L, while the SD-2 and SD-3 were 300 mmol/L.

    Butachlor;Biodegradation;Enrichment;Isolation

    Q5

    A

    1674-2060(2016)02-0006-03

    國(guó)增超(1987—),男,助教,碩士生,主要從事微生物分離純化方面的研究。

    猜你喜歡
    草胺革蘭氏培養(yǎng)箱
    女性下生殖道分泌物檢測(cè)中革蘭氏染色法的應(yīng)用分析
    嬰兒培養(yǎng)箱的質(zhì)控辦法及設(shè)計(jì)改良探討
    五代頭孢有何區(qū)別
    微生物培養(yǎng)箱的選購(gòu)與管理
    食品工程(2020年3期)2020-01-05 14:38:16
    丁草胺及其復(fù)配劑對(duì)水生生物的急性毒性與安全性評(píng)價(jià)
    基于模糊PID參數(shù)自整定的細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度控制算法
    草莓微生物污染分析及革蘭氏陰性細(xì)菌和霉菌鑒定
    除草劑丁草胺的研究進(jìn)展
    綠色科技(2015年2期)2015-03-27 04:29:56
    內(nèi)毒素檢測(cè)在上、下尿路革蘭氏陰性桿菌感染中的診斷價(jià)值
    先正達(dá)完成精異丙甲草胺產(chǎn)能擴(kuò)張
    久久热在线av| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 久久久久久人人人人人| 成人国产综合亚洲| 日日爽夜夜爽网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲五月婷婷丁香| 91国产中文字幕| 这个男人来自地球电影免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 此物有八面人人有两片| 国产精品精品国产色婷婷| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 俺也久久电影网| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 午夜亚洲福利在线播放| 色av中文字幕| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美在线黄色| a级毛片在线看网站| 少妇的丰满在线观看| 91在线观看av| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 90打野战视频偷拍视频| 十分钟在线观看高清视频www| 精品卡一卡二卡四卡免费| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 99久久国产精品久久久| 一本综合久久免费| 午夜福利欧美成人| 视频在线观看一区二区三区| 男女那种视频在线观看| 亚洲成人久久性| 波多野结衣高清作品| 青草久久国产| 一级毛片精品| 精品人妻1区二区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产区一区二久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 色播亚洲综合网| 婷婷丁香在线五月| 国产亚洲av高清不卡| 在线永久观看黄色视频| 国产成人影院久久av| 日韩欧美国产在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 91成年电影在线观看| 人人妻人人澡人人看| 99国产精品99久久久久| 精品久久久久久,| 精品免费久久久久久久清纯| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久久久久久黄片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲 国产 在线| 色综合站精品国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 激情在线观看视频在线高清| 深夜精品福利| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品高清国产在线一区| 午夜福利在线在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日韩三级视频一区二区三区| 在线av久久热| 国产精品国产高清国产av| 久久亚洲精品不卡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲九九香蕉| 欧美大码av| 妹子高潮喷水视频| 免费高清在线观看日韩| 国产精品亚洲av一区麻豆| 中文字幕精品免费在线观看视频| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品一区二区三区四区久久 | 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费在线观看影片大全网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲av美国av| 制服丝袜大香蕉在线| 久久九九热精品免费| 在线av久久热| 99国产精品99久久久久| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲五月天丁香| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲成人久久性| 91成年电影在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲国产欧洲综合997久久, | 亚洲第一av免费看| 成年人黄色毛片网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 搡老岳熟女国产| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 日韩精品免费视频一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 热re99久久国产66热| 国产亚洲精品第一综合不卡| 又大又爽又粗| 在线国产一区二区在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 人人妻人人看人人澡| 波多野结衣av一区二区av| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产激情欧美一区二区| 精品人妻1区二区| 大型av网站在线播放| 久久午夜综合久久蜜桃| 91成人精品电影| cao死你这个sao货| 亚洲在线自拍视频| 波多野结衣av一区二区av| 日本 欧美在线| 人人澡人人妻人| 成人国产一区最新在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美日本视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产真实乱freesex| 欧美日本视频| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产熟女xx| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 美国免费a级毛片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久精品成人免费网站| 国产片内射在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 91在线观看av| 少妇 在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜 | 久9热在线精品视频| 在线播放国产精品三级| 国产黄片美女视频| av中文乱码字幕在线| 久久99热这里只有精品18| 日韩三级视频一区二区三区| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久成人av| 久久精品人妻少妇| 丝袜人妻中文字幕| 老司机深夜福利视频在线观看| 1024香蕉在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久伊人香网站| 亚洲成人久久性| 欧美日韩乱码在线| 国产激情欧美一区二区| 他把我摸到了高潮在线观看| 操出白浆在线播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 一级毛片女人18水好多| 黄色女人牲交| 免费在线观看黄色视频的| 欧美精品啪啪一区二区三区| 波多野结衣高清作品| 国产av又大| 在线观看日韩欧美| 久久久久久国产a免费观看| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲国产欧美一区二区综合| 麻豆国产av国片精品| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 成人免费观看视频高清| 最新美女视频免费是黄的| av中文乱码字幕在线| a级毛片在线看网站| 免费一级毛片在线播放高清视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| www日本在线高清视频| ponron亚洲| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一区二区三区精品91| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日本成人三级电影网站| 91麻豆精品激情在线观看国产| 丝袜人妻中文字幕| 日本熟妇午夜| 午夜福利免费观看在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 禁无遮挡网站| 国产乱人伦免费视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品久久电影中文字幕| 在线视频色国产色| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品免费视频内射| 老汉色∧v一级毛片| 欧美激情高清一区二区三区| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲国产精品999在线| 好男人在线观看高清免费视频 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 中文字幕最新亚洲高清| 美女午夜性视频免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产一区二区激情短视频| 99热这里只有精品一区 | 亚洲欧美日韩高清在线视频| 男人舔女人的私密视频| 丰满的人妻完整版| 免费人成视频x8x8入口观看| 校园春色视频在线观看| 搞女人的毛片| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美大码av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美黄色片欧美黄色片| 香蕉国产在线看| 麻豆一二三区av精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产黄色小视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 婷婷六月久久综合丁香| 中出人妻视频一区二区| 村上凉子中文字幕在线| 精品欧美国产一区二区三| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品日韩av在线免费观看| 天堂影院成人在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品日产1卡2卡| 日本免费一区二区三区高清不卡| 男人操女人黄网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 18禁美女被吸乳视频| 看片在线看免费视频| 免费电影在线观看免费观看| 久久伊人香网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国内精品久久久久久久电影| 男人舔女人的私密视频| 久久久国产成人免费| 一级黄色大片毛片| 欧美在线一区亚洲| 日本熟妇午夜| 听说在线观看完整版免费高清| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 在线视频色国产色| 久久久久国内视频| 国产成人欧美在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 深夜精品福利| 国产麻豆成人av免费视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 老汉色av国产亚洲站长工具| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲国产精品合色在线| 久久天堂一区二区三区四区| 一级作爱视频免费观看| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲九九香蕉| 看黄色毛片网站| 免费高清视频大片| 黄片播放在线免费| 免费在线观看完整版高清| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一a级毛片在线观看| 国产97色在线日韩免费| 日本五十路高清| 久久香蕉激情| 免费在线观看影片大全网站| 后天国语完整版免费观看| 日本成人三级电影网站| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品免费视频内射| 中亚洲国语对白在线视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 长腿黑丝高跟| 日韩大尺度精品在线看网址| 99re在线观看精品视频| 一本久久中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产免费男女视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲五月天丁香| 久久午夜综合久久蜜桃| 18禁观看日本| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产成人av激情在线播放| 97碰自拍视频| 免费看美女性在线毛片视频| 国产亚洲精品av在线| 女性生殖器流出的白浆| 一区二区三区国产精品乱码| 视频区欧美日本亚洲| 国产v大片淫在线免费观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 午夜福利免费观看在线| 男男h啪啪无遮挡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲第一青青草原| 91老司机精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲av成人av| 日日爽夜夜爽网站| 久久久久久大精品| 在线观看舔阴道视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成人精品一区二区免费| 天天添夜夜摸| 国产免费男女视频| 亚洲av熟女| 不卡av一区二区三区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲午夜理论影院| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 不卡av一区二区三区| 日本免费a在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| √禁漫天堂资源中文www| www日本黄色视频网| 91麻豆av在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久国产成人精品二区| 国产99白浆流出| 国产黄色小视频在线观看| 天堂影院成人在线观看| 国产三级在线视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产成人系列免费观看| 很黄的视频免费| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲一区高清亚洲精品| 又紧又爽又黄一区二区| 嫩草影院精品99| 亚洲午夜理论影院| 国产黄色小视频在线观看| 超碰成人久久| 日本a在线网址| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产高清有码在线观看视频 | 麻豆成人av在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 午夜福利在线观看吧| 久久香蕉精品热| 国产精华一区二区三区| 日韩欧美 国产精品| 午夜福利视频1000在线观看| 日韩欧美 国产精品| 日韩有码中文字幕| 欧美亚洲日本最大视频资源| 麻豆成人午夜福利视频| 此物有八面人人有两片| 狂野欧美激情性xxxx| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 国产爱豆传媒在线观看 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产黄a三级三级三级人| av片东京热男人的天堂| 亚洲成人免费电影在线观看| 免费观看人在逋| 男女那种视频在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 老鸭窝网址在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 久久久久久久久久黄片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 午夜影院日韩av| 午夜精品久久久久久毛片777| 在线观看66精品国产| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| av福利片在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品二区激情视频| 中出人妻视频一区二区| 91字幕亚洲| 午夜福利视频1000在线观看| 成年版毛片免费区| 91av网站免费观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久天堂一区二区三区四区| 精品久久蜜臀av无| 国产免费av片在线观看野外av| 久久人妻av系列| 久久久水蜜桃国产精品网| 午夜日韩欧美国产| 国产成人精品无人区| 精品不卡国产一区二区三区| 久久久国产成人免费| 神马国产精品三级电影在线观看 | 超碰成人久久| 视频在线观看一区二区三区| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲一区高清亚洲精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久久久久大精品| 日韩精品中文字幕看吧| or卡值多少钱| 老司机深夜福利视频在线观看| 夜夜爽天天搞| 久久婷婷成人综合色麻豆| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产一区在线观看成人免费| 九色国产91popny在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 韩国av一区二区三区四区| 国产成人精品久久二区二区91| 又紧又爽又黄一区二区| 可以在线观看的亚洲视频| 男女午夜视频在线观看| 亚洲第一电影网av| 19禁男女啪啪无遮挡网站| av电影中文网址| 啪啪无遮挡十八禁网站| 老司机靠b影院| 亚洲成a人片在线一区二区| 一区福利在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲性夜色夜夜综合| 手机成人av网站| 在线观看免费日韩欧美大片| 波多野结衣高清无吗| 特大巨黑吊av在线直播 | 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲av熟女| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产成人av教育| 亚洲第一av免费看| 亚洲人成网站高清观看| 99国产综合亚洲精品| 国语自产精品视频在线第100页| 久久性视频一级片| 国产男靠女视频免费网站| 99热这里只有精品一区 | 日韩免费av在线播放| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费av毛片视频| 日日夜夜操网爽| 日韩欧美免费精品| 午夜两性在线视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产主播在线观看一区二区| 可以在线观看毛片的网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 1024手机看黄色片| 美女大奶头视频| 制服人妻中文乱码| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产乱人伦免费视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 无遮挡黄片免费观看| 制服人妻中文乱码| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲国产看品久久| 啦啦啦韩国在线观看视频| 男女之事视频高清在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品久久久久久精品电影 | 日韩三级视频一区二区三区| 日日夜夜操网爽| 淫秽高清视频在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 母亲3免费完整高清在线观看| 麻豆成人av在线观看| 99riav亚洲国产免费| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 麻豆一二三区av精品| 日韩视频一区二区在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲人成电影免费在线| 午夜a级毛片| 中文字幕av电影在线播放| 国产成人精品无人区| 悠悠久久av| 精品欧美一区二区三区在线| 天堂√8在线中文| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产av又大| 美女免费视频网站| 看免费av毛片| 日韩av在线大香蕉| 好男人电影高清在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 美女国产高潮福利片在线看| 操出白浆在线播放| 两个人免费观看高清视频| 国产精品野战在线观看| 日本 欧美在线| 此物有八面人人有两片| 天堂影院成人在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲精品色激情综合| 一本大道久久a久久精品| 香蕉国产在线看| www日本黄色视频网| 日日夜夜操网爽| 夜夜爽天天搞| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 高清在线国产一区| 亚洲性夜色夜夜综合| 日本黄色视频三级网站网址| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 男女床上黄色一级片免费看| 岛国在线观看网站| 人人妻人人澡人人看| 精品国产美女av久久久久小说| 国产熟女xx| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 美女午夜性视频免费| 国产1区2区3区精品| 中国美女看黄片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品一区二区三区av网在线观看| av视频在线观看入口| 精品电影一区二区在线| svipshipincom国产片| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产午夜精品久久久久久| 黄色成人免费大全| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 女性被躁到高潮视频| 黄色片一级片一级黄色片| 国产一卡二卡三卡精品| 不卡av一区二区三区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品野战在线观看| 精品久久久久久久末码| 91成人精品电影| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精华国产精华精| 欧美日本亚洲视频在线播放| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 人妻久久中文字幕网| av有码第一页| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲全国av大片| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲七黄色美女视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久热在线av| 人成视频在线观看免费观看| 国产av在哪里看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 母亲3免费完整高清在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 色综合站精品国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品久久久久久成人av| 俄罗斯特黄特色一大片| 一区二区三区高清视频在线| www.熟女人妻精品国产| 一夜夜www|