糖尿病模型大鼠痛覺的心理生理學(xué)觀察

蔣佳珅, 袁　佳，邵姚君，劉　菊，傅雨晨，周婷婷，鄭　超，汪萌芽

(皖南醫(yī)學(xué)院　1.細(xì)胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽　蕪湖　241002)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

糖尿病模型大鼠痛覺的心理生理學(xué)觀察

蔣佳珅1,2, 袁佳1,2，邵姚君1,2，劉菊1,2，傅雨晨1,2，周婷婷1,2，鄭超1，汪萌芽1

(皖南醫(yī)學(xué)院1.細(xì)胞電生理研究室；2.啟明星小組，安徽蕪湖241002)

目的：探討糖尿病模型大鼠的痛反應(yīng)、痛感覺、痛情緒的變化及其心理生理特性。方法：成年SD大鼠18只隨機均分為對照組和糖尿病模型組，模型組用鏈唑霉素(STZ)腹腔注射法制備。在造模前、造模后第21天，檢測兩組大鼠的光輻射熱甩尾反應(yīng)潛伏期。并在第21天的檢測后，對麻醉大鼠的痛感覺代表區(qū)異顆粒區(qū)(DZ)和痛情緒代表核團基底外側(cè)杏仁核(BLA)電活動，以及心電、呼吸肌肌電、皮膚電導(dǎo)、體溫進行心理生理學(xué)記錄，并觀察熱、夾尾刺激的影響。結(jié)果：模型組大鼠血糖在STZ注射后維持在>16 mmol/L，其甩尾反應(yīng)潛伏期較正常組縮短(P<0.01)。模型組大鼠的BLA基礎(chǔ)放電頻率高于正常組(P<0.01)，兩組大鼠BLA、DZ的放電頻率在兩種傷害性刺激時均提高(P<0.05)，熱刺激時，模型組大鼠反應(yīng)時BLA、DZ的放電頻率增加高于正常組(P<0.05)，而在夾尾刺激時，模型組僅BLA的放電頻率增加高于正常組(P<0.05)。同時，兩種刺激導(dǎo)致兩組大鼠均出現(xiàn)心率、呼吸頻率加快，但正常組在熱刺激后心率、呼吸頻率較快恢復(fù)，模型組未完全恢復(fù)(P<0.01)。結(jié)論：糖尿病模型大鼠的痛反應(yīng)顯著敏化，且傷害性刺激所誘發(fā)的痛感覺、痛情緒及其生理反應(yīng)亦明顯增強。

糖尿病神經(jīng)病理性痛；痛反應(yīng)；痛覺；痛情緒；心理生理學(xué)

國際疼痛研究協(xié)會(IASP)將慢性疼痛定義為“超過正常的組織愈合時間的疼痛”[1]。 慢性疼痛不僅給患者帶來軀體的痛苦，而且使患者在心理上承受沉重的壓力，導(dǎo)致生活質(zhì)量的嚴(yán)重受損。盡管已有較多研究提示，慢性疼痛是一種腦功能障礙性疾病，因改變大腦腦區(qū)間的信息交流和整合，進而影響腦的功能、心理，以及行為活動[2]，但慢性疼痛的產(chǎn)生機制仍是需要進一步研究的熱點課題。在臨床上，各種疾病所致的周圍神經(jīng)病變是引起慢性疼痛較為常見的原因，而糖尿病神經(jīng)病理性痛是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一[3]。注射鏈唑霉素可損壞胰島素內(nèi)分泌細(xì)胞，使大鼠體內(nèi)血糖濃度快速上升且這種高血糖水平能穩(wěn)定地維持?jǐn)?shù)月，形成糖尿病。這種糖尿病模型可導(dǎo)致大鼠長時間的熱和機械痛覺過敏[4]，這為研究疾病所致的慢性疼痛的病程發(fā)展提供了一個可靠的模型。本文旨在應(yīng)用心理生理學(xué)實驗技術(shù)，觀察和探究在疾病所致的慢性疼痛的痛感覺、痛情緒代表核團的電活動和外周生理指標(biāo)的變化以及三者間的相關(guān)性，為進一步認(rèn)識痛感覺、痛情緒和相關(guān)生理指標(biāo)變化與慢性疼痛病情發(fā)展的關(guān)系，以及深入研究慢性疼痛發(fā)展變化的機制，提供參考。

1　材料與方法

1.1動物選用成年雄性SD大鼠(體質(zhì)量240～260 g)18只，由南京青龍山動物繁殖場提供，動物合格證號SCXK(浙)2014-0001。分組飼養(yǎng)，自由取食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2藥品與儀器鏈唑霉素(streptozotocin，STZ)，血糖儀(Accu-Chek Active,Roche Diagnostics GmbH,German)，光輻射熱測痛儀(LE 7106 Light Beam Analgesy-Meter, Panlab,USA)，Model 1800 雙通道微電極放大器(A-M Systems，USA)、Powerlab生理信號采集與分析系統(tǒng)(含Chart Pro軟件，澳大利亞)、充氣防震臺(江西連勝實驗裝備有限公司)、手術(shù)顯微鏡、腦立體定位儀(上海奧爾科特生物科技有限公司)、電鉆、恒溫毯(上海奧爾科特生物科技有限公司)、同芯不銹鋼電極、雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽室、常規(guī)動物手術(shù)器械等。

1.3模型制備及分組18只大鼠隨機均分為模型組和對照組。模型大鼠制備：9只大鼠禁食 16 h后，按 60 mg/kg一次性腹腔注射3% (W/V)STZ溶液。對照組注射等量的生理鹽水。兩組大鼠分別在注射STZ或生理鹽水前及注射后7、14、21 d測尾靜脈血糖，血糖持續(xù)≥16 mmol/L則為糖尿病模型大鼠[5]。

1.4實驗方法

1.4.1光輻射熱甩尾反應(yīng)潛伏期測定將兩組大鼠分別于造模前、造模后第21天進行光輻射熱甩尾反應(yīng)測試，即應(yīng)用光輻射熱測痛儀，分別測定各大鼠在不同光刺激強度(Focus=10、15、23、34、51、76)下甩尾反應(yīng)的潛伏期(潛伏期>20 s的記為20 s)。獲得光輻射熱甩尾反應(yīng)的時反應(yīng)量-效關(guān)系(TDRR)數(shù)據(jù)。

1.4.2多項生理指標(biāo)及腦內(nèi)雙核團細(xì)胞外記錄大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(1.5 ml/kg)，待麻醉后將大鼠置于37.0℃保溫毯上，頭部固定于腦立體定位儀上，整個實驗裝置置于雙層銅網(wǎng)電生理屏蔽罩內(nèi)的防震臺上。固定大鼠頭顱后，暴露顱骨，按Paxinos和Watson大鼠立體定位圖譜確定異顆粒區(qū)(DZ)、基底外側(cè)杏仁核(BLA)的電極尖端位置[6]，DZ：前囟前后(AP)0.48～-3.30 mm，旁開(L)3.50～4.60 mm，背腹深度(DV)0.80～3.00 mm； BLA：AP -1.56～-3.36 mm，旁開(R)3.90～4.60 mm，DV 7.80～8.82 mm，建立六通道(皮膚電導(dǎo)、肌電、心電、體溫、BLA、DZ)同步記錄。記錄20 min基礎(chǔ)數(shù)值后，對尾部外1/3處依次進行①熱刺激，50℃，10 s；②夾尾刺激，10 s，強度以大鼠四肢抽動為宜，刺激間隔時間為20 min，同時記錄腦核團放電頻率及外周生理指標(biāo)的變化[7]。

1.4.3信號采集的參數(shù)由記錄電極引導(dǎo)的生物電信號經(jīng)放大器放大后，導(dǎo)入PowerLab 8通道生理信號采集系統(tǒng)，通過Chart軟件進行信號采集、存盤，采樣頻率為10 kHz。心電信號設(shè)置為高通10 Hz、低通200 Hz，呼吸肌肌電信號為高通0.1 Hz、低通200 Hz，設(shè)置皮膚電導(dǎo)信號量程為10 μS，腦內(nèi)核團BLA、DZ細(xì)胞外記錄的生物電信號設(shè)置為高通10 Hz、低通2 kHz，體溫信號設(shè)置低通為10 Hz。

1.5數(shù)據(jù)分析

1.5.1記錄信號的分析呼吸肌肌電周期用Chart Pro軟件中周期測量功能進行分析，即設(shè)150 Hz的高通濾波，按數(shù)據(jù)模擬的準(zhǔn)確程度適當(dāng)調(diào)整最小周期與最小峰高S.D.，再將數(shù)據(jù)添加到數(shù)據(jù)板，所算出的均數(shù)即為平均肌電周期。對其他記錄到的信號，亦用Chart Pro軟件進行常規(guī)測量和分析，其中核團電活動的頻率采用放電頻率直方圖反映、幅值則是選定時間的每2 s內(nèi)信號幅度最大值減去最小值的平均值。

2　結(jié)果

2.1大鼠血糖、體質(zhì)量的變化9只模型組大鼠血糖在注射STZ后的第7、14、21天檢測均維持>16 mmol/L水平，糖尿病發(fā)生率為100%(表1)。同時觀察到模型組大鼠在注射STZ后第2天就出現(xiàn)多飲、多食、多尿。與對照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量在造模后第1周明顯下降，后兩周體質(zhì)量無明顯增長(表1)。與對照組大鼠相比，還觀察到糖尿病模型大鼠的毛色暗淡、肌肉萎縮、尾靜脈采血點愈合緩慢，安靜休息時間增多，自發(fā)活動和理毛動作減少。

指標(biāo)組別注射前注射后7d14d21d體質(zhì)量/g對照組270.5±15.0288.2±12.4305.7±9.3318.5±11.1模型組270.8±6.5255.2±16.6*#260.6±14.2*#259.1±14.1*#血糖/(mmol/L)對照組4.7±1.37.5±0.57.3±0.57.8±0.4模型組5.2±0.730.9±2.3*#31.7±1.5*#32.3±1.4*#

與注射前比：*P<0.05, 與對照組相比：#P<0.05。

2.2兩組大鼠甩尾反應(yīng)潛伏期的比較分析兩組大鼠在不同光輻射熱刺激強度(Focus=10、15、23、34、51、76)下甩尾反應(yīng)的潛伏期，結(jié)果顯示在各刺激強度下，模型組大鼠甩尾反應(yīng)潛伏期低于對照組(P<0.01,圖1)。

圖1兩組大鼠甩尾反應(yīng)潛伏期時反應(yīng)量-效關(guān)系的比較

2.3兩組大鼠BLA、DZ電活動基礎(chǔ)值的比較對兩組大鼠兩核團前20 min基礎(chǔ)記錄數(shù)據(jù)分析顯示，模型組大鼠的BLA基礎(chǔ)平均放電頻率1.99 Hz，顯著高于對照組的1.69 Hz(P<0.01，圖2A)，而兩組比較DZ的放電頻率變化不明顯(圖2B)。BLA和DZ核團放電頻率的相關(guān)系數(shù)在對照組大鼠為r=0.685(P=0.029)，在模型組大鼠為r=0.823(P=0.006)。

2.4熱刺激引起的反應(yīng)

2.4.1熱刺激對兩組大鼠BLA、DZ放電頻率的影響在熱刺激后，對兩組大鼠進行BLA、DZ放電頻率直方圖分析，結(jié)果顯示對照組有8只、模型組有7只大鼠出現(xiàn)刺激后兩核團放電頻率增高。對誘發(fā)反應(yīng)大鼠的熱刺激前2 min、峰反應(yīng)時及峰反應(yīng)后2 min的核團放電頻率進行統(tǒng)計學(xué)分析顯示(圖3)，兩組大鼠反應(yīng)時BLA、DZ放電頻率相對刺激前有明顯增加(P<0.01)，對照組BLA反應(yīng)后相對反應(yīng)時放電頻率恢復(fù)(P<0.01)，而模型組BLA反應(yīng)后并未恢復(fù)，頻率仍較刺激前高(P<0.05)。將峰反應(yīng)時與刺激前放電頻率之比記作反應(yīng)的放電頻率變化率，將兩組大鼠熱刺激引起的放電頻率變化率進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示模型組反應(yīng)時BLA、DZ放電頻率變化率高于對照組(P<0.05)。

圖2兩組大鼠BLA(A)、DZ(B)基礎(chǔ)放電頻率的比較

2.4.2熱刺激對兩組大鼠生理指標(biāo)的影響對兩組大鼠熱刺激前、反應(yīng)時、反應(yīng)后的心率、呼吸肌肌電頻率進行分析，觀察到兩組大鼠均出現(xiàn)反應(yīng)時較刺激前心率及呼吸頻率加快的現(xiàn)象(圖4A、B，P<0.01)。且對照組中，反應(yīng)后大鼠心跳加快后又恢復(fù)(P<0.01)，而在模型組中，熱刺激心率未完全恢復(fù)(P<0.01)。進一步分析兩組大鼠刺激時的心率變化率及呼吸變化率，模型組的心率變化率及呼吸變化率均大于對照組(P<0.01)。

圖3熱刺激對兩組大鼠BLA(A)、DZ(B)放電頻率的影響

圖4熱刺激對兩組大鼠心率(A)、呼吸頻率(B)的影響

2.5夾尾刺激引起的反應(yīng)

2.5.1夾尾刺激對兩組大鼠BLA、DZ放電的影響在夾尾刺激后，分析兩組大鼠核團放電頻率直方圖，結(jié)果顯示對照組有7只、模型組有8只大鼠出現(xiàn)刺激后兩核團放電頻率增高的現(xiàn)象。對誘發(fā)反應(yīng)大鼠的夾尾刺激前2 min、峰反應(yīng)時及峰反應(yīng)后2 min的核團放電頻率進行統(tǒng)計學(xué)分析顯示，兩組大鼠反應(yīng)時BLA、DZ放電頻率較刺激前增加(P<0.01)。分析兩組大鼠夾尾刺激引起的放電頻率變化率(圖5)，模型組BLA放電頻率變化率高于對照組(P<0.05)，兩組的DZ放電頻率變化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5夾尾刺激兩組大鼠BLA(A)、DZ(B)放電頻率變化率的比較

2.5.2夾尾刺激對兩組大鼠生理指標(biāo)的影響對兩組大鼠夾尾刺激前、刺激時、刺激后的心率、呼吸肌肌電頻率進行分析，結(jié)果顯示，兩組大鼠均出現(xiàn)刺激時較刺激前心率及呼吸頻率加快(P均<0.01)。模型組的心率變化率及呼吸變化率均大于對照組(圖6，P<0.01)。

圖6夾尾刺激兩組大鼠心率(A)、呼吸肌肌電頻率(B)變化率的比較

3　討論

本實驗采用注射鏈唑霉素(STZ)損傷胰島β細(xì)胞的方法來誘導(dǎo)糖尿病。相較于其他造模方式，此方法具有穩(wěn)定、快速、組織毒性相對較小等優(yōu)點[5]。同時造模過程中需注意，STZ易見光分解， 配置溶液時應(yīng)快速完成，且配置完后置于避光容器中，將容器置于冰水混合物中，減少藥效損失。注射后立即將大鼠倒立，有利于藥物流向位置較低的胰腺部位，可直接與胰腺接觸，破壞胰島，提高造模成功率[8]。本實驗采用的是SD大鼠，有實驗表明SD大鼠對STZ的抵抗力強于Wistar大鼠[9]，同時給藥后需加強飼養(yǎng)，勤換墊料，采完血后采血部位涂抹抗生素軟膏，防止感染，所以試驗中模型組大鼠的死亡率較低。本實驗在注射STZ后測得隨機血糖>16 mmol/L，這也與文獻報道中測得的大鼠空腹血糖檢測相近[9-10]。

由于機械刺激和熱刺激對感受器有抑制或致敏作用[5]，這會導(dǎo)致后續(xù)的無論是甩尾反應(yīng)還是核團記錄時產(chǎn)生誤差，此作用依賴于兩次刺激的時間間隔，完全恢復(fù)需要10 min以上，故本實驗光熱刺激時間間隔為10 min，核團記錄時刺激間隔為20 min。此外，有研究表明同一大鼠夜間疼痛閾值明顯高于白天，上午和下午的痛閾也存在差異[11]。故本實驗的光輻射熱甩尾反應(yīng)檢測定點于上午8點至10點進行。大部分的文獻報道都指出：注射STZ 1周后，大鼠機械痛閾和熱痛閾開始下降[12]，本實驗中，注射STZ 3周后，在各光熱刺激強度下，模型組大鼠甩尾反應(yīng)潛伏期均明顯低于對照組，與國外相應(yīng)報道[12-13]一致，表明糖尿病神經(jīng)病理性痛大鼠的痛反應(yīng)顯著敏化。

本實驗采用腦內(nèi)雙核團細(xì)胞外記錄和多項生理指標(biāo)同步記錄技術(shù)，既可檢測在傷害性刺激時腦內(nèi)痛感覺代表區(qū)和痛情緒代表核團的放電頻率，還能將反映情緒反應(yīng)的多項生理指標(biāo)進行同步分析，構(gòu)成了痛覺的綜合性心理生理學(xué)記錄和分析系統(tǒng)[6-7]。結(jié)果表明，模型組大鼠BLA的基礎(chǔ)放電頻率高于對照組，DZ無顯著差異?？梢钥闯?，與痛情緒相關(guān)的核團BLA的興奮性增高。而在對于熱刺激的反應(yīng)中，對照組BLA反應(yīng)后放電頻率恢復(fù)，而模型組BLA反應(yīng)后并未恢復(fù)，頻率仍較刺激前高。這表明，神經(jīng)病理性疼痛大鼠在熱刺激時誘發(fā)了BLA更為長時程的放電反應(yīng)。與之相應(yīng)的是對照組中，熱刺激后大鼠心跳加快后又恢復(fù)，而在模型組中，熱刺激心率均未完全恢復(fù)。由此推測熱刺激引起了神經(jīng)病理性痛大鼠更為強烈及持久的痛情緒反應(yīng)。而在夾尾刺激引起的反應(yīng)中，兩組大鼠反應(yīng)時BLA、DZ放電頻率較刺激前有明顯增加，模型組BLA放電頻率變化率高于對照組，DZ放電變化率則相似。這表明糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠在夾尾刺激時更易誘發(fā)明顯的BLA放電變化。據(jù)此推測，在大鼠糖尿病神經(jīng)病理性疼痛中，處理痛情緒的中樞對刺激可能更加敏感，反應(yīng)時間也更長。

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Psychophysiological observations of the pain in diabetic rats

JIANG Jiashen, YUAN Jia,SHAO Yaojun, LIU Ju, FU Yuchen,ZHOU Tingting,ZHENG Chao，WANG Mengya

Cell Electrophysiology Laboratory，Wannan Medical College，Wuhu 241002, China

Objective：To investigate the underlying psychophysiological mechanisms of diabetes-induced pain in rat models via observing the changes of pain response, sensation and emotion in model rats. Methods:Eighteen adult male rats were randomized into control group and diabetic model group. Rat models were induced by intraperitneal injection of streptozotocin (STZ), and light radiant heat test was performed to measure the tail-flick latency of rats in the two groups before and on day 21 after STZ induction. Electrical activities at dysgranular zone (DZ), the pain sensation-related brain region,and basolateral amygdala (BLA) ,the pain emotion-related nucleus were both extracellularly recorded with simultaneous observation of physiological functions, including electrocardiograph, electromyography of respiratory muscles, skin conductance and body temperature, in anaesthetized rats. Thermal stimulation and tail pinch stimulation were used to elicit nociceptive responses. Results:The model rats had blood glucose concentration over 16 mmol/L after injection of STZ, significantly shortened tail-flick latency(P<0.01),and higher BLA basal firing rate(P<0.01). Although the firing rate of BLA and DZ was increased in both groups by the two types of stimulation (P<0.05), yet rats in model group had increased firing rate at BLA and DZ to the radiant test(P<0.05), and exclusively increased BLA firing rate to the tail pinch(P<0.05). The heart rate and the respiratory rate were increased in both groups by two types of stimulation, and recovery of the heart and respiratory rate was quicker following stimulation in the control group, whereas was incomplete in model group(P<0.01). Conclusion:The pain response appears more sensitized for diabetic rats that have significantly enhanced pain sensation, pain emotion and physiological functions under nociceptive stimulations.

diabetic neuropathic pain; pain response; pain sensation; pain emotion; psychophysiology

1002-0217(2016)05-0409-06

安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目 (AH201410368062)；人文與管理學(xué)院大學(xué)生科研培育基金項目 (RG201430)；國家自然科學(xué)基金項目(31271155)

2016-07-11

蔣佳珅(1993-)，女，2011級醫(yī)學(xué)影像學(xué)專業(yè)本科生，(電話)18355351121，(電子信箱)j1j1s93@163.com；

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A

10.3969/j.issn.1002-0217.2016.05.001

汪萌芽，男，教授，碩士生導(dǎo)師，博士，(電子信箱)wangmy@wnmc.edu.cn，通信作者.