南方紅豆杉枝葉與果實(shí)中6種紫杉烷類化合物含量分析

楊星星，王仁才*，張家銀，李炎林，秦宇，熊興耀,2*

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南方紅豆杉枝葉與果實(shí)中6種紫杉烷類化合物含量分析

楊星星1，王仁才1*，張家銀3，李炎林1，秦宇1，熊興耀1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128)

以南方紅豆杉的枝、葉、果實(shí)為材料，建立了高效液相色譜法同時測定6種紫杉烷類化合物(紫杉醇、三尖杉寧堿、7–表–10–去乙酰紫杉醇、7–表–紫杉醇、巴卡亭III、10–去乙酰巴卡亭III)含量的方法。結(jié)果表明：以甲醇–乙腈–水(體積比為25∶36∶39)為流動相，等度洗脫，檢測波長227 nm，6種紫杉烷類化合物在35 min 內(nèi)完全分離；南方紅豆杉的枝、葉、果實(shí)中6種紫杉烷類化合物含量存在差異，其中，紫杉醇和7–表–10–去乙酰紫杉醇在種胚中含量最高，分別為866.47、722.50 μg/g，10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III和7–表–紫杉醇在葉中的含量最高，分別為301.20、234.08、11.74 μg/g，三尖杉寧堿含量最高的部位是枝，為392.69 μg/g。

南方紅豆杉；枝葉；果實(shí)；紫杉醇；紫杉烷；高效液相色譜法

紫杉醇是從紅豆杉科紅豆杉屬植物中分離得到的一種四環(huán)二萜類生物堿[1]，是世界上公認(rèn)的高效、廣譜天然抗癌藥物，自1992 年被美國食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)作為晚期卵巢癌的治療藥物以來，其臨床應(yīng)用范圍已擴(kuò)展到乳腺癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌等多種癌癥的治療[2]。最新的臨床研究表明，紫杉醇可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3]、早老年性癡呆[4]和先天性多囊腎病[5]等。隨著其療效的確認(rèn)，需求量越來越大，但紅豆杉屬植物中的紫杉醇含量極低，野生的紅豆杉屬于國家一級保護(hù)樹種，禁止砍伐。天然的紫杉醇主要來源人工栽培的紅豆杉，但是紅豆杉生長緩慢，從植物中直接提取紫杉醇無法滿足市場需求。紫杉醇的全合成已在實(shí)驗(yàn)室獲得成功，但效率太低，不具備商業(yè)價值[6]。目前紫杉醇的主要來源是從紅豆杉的枝葉中提取含量較高的紫杉烷，再化學(xué)半合成紫杉醇[7]。

紫杉烷是紫杉醇的合成代謝相關(guān)化合物及其衍生物，目前已分離鑒定了400 多種紫杉烷類化合物。由于紫杉烷類化合物與紫杉醇結(jié)構(gòu)的相似性，不少紫杉烷類化合物具有抗癌活性，還有一些紫杉烷類化合物可以通過結(jié)構(gòu)修飾改造成紫杉醇甚至藥效更好的化合物，如多烯紫杉醇[8]。

本研究以南方紅豆杉的枝葉、果實(shí)為材料，建立了同時檢測紅豆杉枝葉果實(shí)中6 種紫杉烷類化合物的高效液相色譜法，分析了南方紅豆杉不同部位紫杉醇以及相關(guān)紫杉烷類化合物的含量，旨在探明紫杉醇含量較高的部位，為南方紅豆杉資源綜合利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料采自湖南省瀏陽市大圍山的南方紅豆杉((Pilger) Rehd.var.Cheng et L. K. Fu)，約50年生，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所熊興耀教授鑒定。

試劑：甲醇，乙腈(色譜純，美國MERK公司)；超純水(由英國ELGA公司生產(chǎn)的純水儀制備)；其他試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；紫杉醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99.6%，批號 100382–201102)，7–表– 10–去乙酰紫杉醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號 100925– 201102)，7–表–紫杉醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號100927–201102)，三尖杉寧堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號 100926–201102)購自中國食品藥品檢定研究院；10–去乙酰巴卡亭III(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號 CRM009749)，巴卡亭III(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號CRM009301)購自美國International Laboratory (IL)。

主要儀器和設(shè)備：Agilent 1260 高效液相色譜儀；色譜柱ZORBAX SB–C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) (美國Agilent 公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE–5200A)；KQ–52000DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AB104 電子天平(瑞士METTLER公司)。

1.2方法

1.2.1樣品采集

試驗(yàn)于2014年進(jìn)行。在南方紅豆杉果實(shí)成熟期，從植株東、南、西、北4個方向隨機(jī)采集當(dāng)年生的枝、葉、果實(shí)各約2 kg，再把果實(shí)分為假種皮、種皮、種胚3部分，將材料按部位混合均勻，放置?80 ℃冰箱凍存，備用。

1.2.2色譜條件

色譜柱為ZORBAXSB–C18( 250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇–乙腈–水(體積比為25∶36∶39)，等度洗脫35 min，流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃，紫外檢測波長227 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品10–去乙酰巴卡亭III(10.4 mg)、巴卡亭III(10.0 mg)、三尖杉寧堿(21.0 mg)、紫杉醇(20.2 mg)、7–表–10–去乙酰紫杉醇(19.6 mg)、7–表–紫杉醇(20.0 mg)，置于5 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制單標(biāo)準(zhǔn)溶液作為貯備液。以6 種單標(biāo)準(zhǔn)溶液為基礎(chǔ)，配制含6 種標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使溶液中的10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿、紫杉醇、7–表–10–去乙酰紫杉醇、7–表–紫杉醇最終質(zhì)量濃度分別為0.204、0.196、0.412、0.402、0.384、0.392 mg/mL，于4 ℃冰箱中儲存，備用。

分別精密移取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.015、0.060、0.200、0.600、0.800、1.000、1.250 mL置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容。按1.2.2色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)()，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(，μg/mL)，進(jìn)行線性回歸，得到10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿、紫杉醇、7–表–10–去乙酰紫杉醇、7–表–紫杉醇的線性回歸方程及線性關(guān)系。

1.2.4樣品溶液的制備

參照文獻(xiàn)[9]的方法并稍作改進(jìn)。分別稱取2.0 g枝、葉、假種皮、種皮、種胚于研缽中，液氮研磨至粉末狀，置于50 mL離心管中，加入 20 mL甲醇，在超聲功率200 W，溫度25 ℃時超聲提取30 min，2 000 r/min離心15 min，取上清液。重復(fù)3次，合并上清液，加適量石油醚除去非極性色素，于45 ℃下減壓、濃縮、干燥，加10 mL甲醇溶解，過0.45 μm 微孔濾膜，收集濾液，備用。

1.2.5方法學(xué)考察

參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行。

1) 精密度試驗(yàn)。取1.2.3中混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.2.2色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積，計算6種紫杉烷類化合物峰面積的。

2) 穩(wěn)定性試驗(yàn)。在1.2.2色譜條件下，將新制備的同一份供試溶液，室溫條件下放置，分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)行取樣測定，記錄峰面積，計算6種紫杉烷類化合物峰面積的。

3) 重現(xiàn)性試驗(yàn)。稱取樣品6份，每份2.0 g，按穩(wěn)定性試驗(yàn)方法制備成甲醇提取液，在1.2.2中色譜條件下測定，記錄峰面積，計算6種紫杉烷類化合物峰面積的。

4) 加樣回收率試驗(yàn)。按照樣品含量的80%、100%和120%添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液。重復(fù)2次。按照樣品制備方法進(jìn)行超聲提取，濃縮后定容，再進(jìn)行含量檢測，計算加樣回收率。

1.2.6樣品的測定

將制備的樣品溶液在1.2.2色譜條件下進(jìn)樣檢測，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間對比，測出每個樣品中所含目標(biāo)化合物的峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線將每個目標(biāo)化合物的峰面積換算成質(zhì)量濃度(1，μg/mL)。

1.2.7紫杉烷類化合物含量計算

含水量測定方法：稱取不同樣品質(zhì)量1約2.0 g，置于105 ℃下烘干至恒重，放置干燥箱冷卻并稱質(zhì)量2，則含水量=1–2/1。重復(fù)3次，取平均值[11]。不同部位材料中紫杉烷的含量均折算成干重含量，根據(jù)下列公式計算，=1×/(1×(1–)。式中為樣品中紫杉烷含量(μg/g)；1為高效液相色譜法檢測的紫杉烷濃度(μg/mL)；為樣品體積(mL)。重復(fù)6次，結(jié)果取平均值。

1.2.8數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性分析采用單因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1HPLC 分析結(jié)果

以甲醇–乙腈–水(體積比為25∶36∶39)為流動相，等度洗脫35 min，在此色譜條件下，高效液相色譜圖基線穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液中組分分離度好，6種紫杉烷類化合物保留效果較好，達(dá)到基線分離(圖1)。與中國藥典的檢測方法對比，洗脫時間更短，檢測的化合物種類更多。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果顯示，10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿、紫杉醇、7–表–10–去乙酰紫杉醇、7–表–紫杉醇的質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好(表1)。

表1 6種標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程和線性范圍

2.2方法學(xué)考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)檢測條件下，10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿、紫杉醇、7–表–10–去乙酰紫杉醇、7–表–紫杉醇的色譜峰面積的分別為0.38%、0.34%、0.48%、0.49%、0.53%、0.47%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)檢測條件下，10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿、紫杉醇、7–表–10–去乙酰紫杉醇、7–表–紫杉醇的峰面積的分別為0.78%、1.19%、0.89%、0.73%、0.89%、1.22%，說明6 種紫杉烷類化合物在24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿、紫杉醇、7–表–10–去乙酰紫杉醇、7–表–紫杉醇的色譜峰面積的分別為1.01%、0.98%、1.26%、1.89%、1.07%、1.13%，表明方法重現(xiàn)性良好。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III、三尖杉寧堿、紫杉醇、7–表–10–去乙酰紫杉醇、7–表–紫杉醇的平均回收率分別為98.3%、102.2%、106.5%、99.1%、104.3%、101.5%，分別為1.97%、2.16%、1.98%、2.13%、1.91%、2.11%。

2.3樣品的測定結(jié)果

由表2可知，不同紫杉烷類化合物在南方紅豆杉植株中不同部位的含量差異較大。方差分析結(jié)果顯示，不同部位紫杉醇含量存在顯著差異，其中種胚中紫杉醇含量最高，平均含量為866.47 μg/g，接下來依次是種皮、枝、葉，假種皮紫杉醇含量最低，為23.33 μg/g。10–去乙酰巴卡亭III在葉中含量最高，為301.20 μg/g；其次是枝，為158.01 μg/g，其在種胚和種皮中的含量分別為124.09、116.05 μg/g。巴卡亭III在葉中含量最高，為234.08 μg/g，假種皮未檢測到巴卡亭III。三尖杉寧堿含量最高的部位是枝，為392.69 μg/g；含量最低的部位是種胚，為26.16 μg/g，在假種皮中未檢測到。7–表–10–去乙酰紫杉醇在種胚中的含量為722.50 μg/g，葉中的含量為237.20 μg/g，其他部位未檢測到。7–表–紫杉醇僅在葉中檢測到，為11.74 μg/g。

表2　不同部位紫杉烷類化合物的含量

同列不同大寫字母表示差異極顯著；不同小寫字母表示差異顯著。

3　結(jié)論與討論

研究[12]表明，同一紅豆杉不同部位的紫杉醇含量高低順序依次為樹皮、根皮、側(cè)枝、種子、須根、嫩枝、葉，含量最高部位為樹皮，均值可達(dá)418 μg/g。本研究結(jié)果表明，紫杉醇含量最高的部位是種胚，但種胚是否是南方紅豆杉植株中紫杉醇積累最多的部位還需要進(jìn)一步研究。

10–去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III是生物合成紫杉醇的重要前體物質(zhì)，也是化學(xué)合成紫杉醇的重要原材料，研究其含量分布規(guī)律，不僅有助于理解紫杉醇合成轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，還可以為紫杉醇的化學(xué)半合成提供新材料。研究[13]表明，10–去乙酰巴卡亭III、巴卡亭III在枝葉中含量最高，本試驗(yàn)結(jié)果表明葉中的10–去乙酰巴卡亭III含量最高，其次是枝。本研究發(fā)現(xiàn)種胚和種皮中含有豐富的前體化合物10–去乙酰巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ，種胚及其附近組織有充足的合成前體，可能有助于種胚大量積累紫杉醇。

目前所用紫杉醇主要從紅豆杉的樹皮和根中提取[14–15]，而枝葉與果實(shí)是植株每年不斷生長更新的部位，與采集紅豆杉的樹皮和根相比，采集紅豆杉的枝葉果實(shí)對植株的傷害更小，因此，在大規(guī)模提取紅豆杉中紫杉醇時，可以考慮用紅豆杉的枝葉與果實(shí)來代替樹皮。

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Content analysis on 6 kinds of taxanes in branches, leaves and fruits ofvar

Yang Xingxing 1, Wang Rencai1*, Zhang Jiayin3, Li Yanlin1, Qin Yu1, Xiong Xingyao1,2*

(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.The Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3.State Key Laboratory of Sub-health Intervention Technology, Changsha 410128, China)

The branches, leaves and fruits ofvarfrom Dawei mountain in Liuyang city were used as material, to establish a high performance liquid chromatograph (HPLC) method for simultaneous determination of 6 taxanes, namely, paclitaxel, cephalomannine (CE), 7– epi–10–deacetyl paclitaxel( 7–epi–10–DAT), 7–epi–paclitaxel, baccatin III and 10–deacetyl baccatin III (10–DAB). The result indicated that six kinds of taxanes were thoroughly separated within 35 min under the condition of using methanol-acetonitrile-water (volume rate of 25∶36∶39) as mobile phase throughisocratic elution and the detection wavelength of 227 nm. The contents of six taxanes in the branches, leaves and fruits ofvarwere differences, which the paclitaxel and 7– epi–10–deacetyl paclitaxel were the highest (866.47 、722.50 μg/g ) in embryo, the 10–deacetyl baccatin III, baccatin III and 7–epi–paclitaxel were the highest (301.20、234.08、11.74 μg/g ) in leaves, while the highest contents of cephalomannine was in branches (392.69 μg/g).

var.; branch leaves; fruit; paclitaxel; taxanes;high performance liquid chromatography (HPLC)

S791.49

A

1007-1032(2016)05-0549-05

2016–03–25

2016–08–30

國家國際科技合作項(xiàng)目(2013DFG32060)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(13QN14，15QN27)

楊星星(1987—)，男，湖南邵陽人，博士研究生，主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)與利用研究，youngstars@163.com；*通信作者，熊興耀，主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)與利用研究，教授，xiongxingyao@caas.cn；*通信作者，王仁才，教授，主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)與利用研究，wangrenc@163.com

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責(zé)任編輯：尹小紅

英文編輯：梁和