腦紅蛋白對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用的研究

李 直，李依芃，鄧錦波

河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004

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腦紅蛋白對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用的研究

河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004

腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是一種六配位血紅素單體球蛋白，被發(fā)現(xiàn)在機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)以及其他器官與組織中均會(huì)有不同程度的表達(dá)。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，腦紅蛋白的升高可以減少神經(jīng)元受到的損傷。研究表明，腦紅蛋白是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)分子，腦紅蛋白的超表達(dá)在清除活性氧物質(zhì)、減輕一氧化氮引起的損傷、減少神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病、創(chuàng)傷性腦損傷的保護(hù)等中的作用更為顯著。然而，其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全明確。本文對(duì)腦紅蛋白的結(jié)構(gòu)、分布、神經(jīng)保護(hù)作用以及可能的機(jī)制做一簡(jiǎn)單介紹。

腦紅蛋白；六配位結(jié)構(gòu)；神經(jīng)保護(hù)

血紅蛋白(hemoglobin，HB)和肌紅蛋白(myoglobin，MB)曾經(jīng)被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物的僅有的球蛋白類型。HB通常存在于脊椎動(dòng)物的紅細(xì)胞中，由兩個(gè)相同的α鏈和β鏈組成，具有運(yùn)輸氧的功能，可以從肺部運(yùn)送氧到組織；MB主要存在于肌肉中，是由一條蛋白鏈以及一個(gè)血紅素輔基組成的，主要在肌肉內(nèi)運(yùn)輸和儲(chǔ)存氧的單體蛋白。2000年，一種新的球蛋白被首次發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物的大腦，因而被稱為腦紅蛋白(neuroglobin， NGB)[1]。由于體內(nèi)的球蛋白已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以作為氧氣的運(yùn)輸、儲(chǔ)存蛋白以及氧傳感器等功能，所以與氧有著高親和力的NGB被推測(cè)在常氧或者缺氧條件下的生理及病理過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

1　腦紅蛋白的結(jié)構(gòu)、分布

圖1　六配位球蛋白與五配位球蛋白之間的平衡左側(cè)是遠(yuǎn)端HisE7占據(jù)第六個(gè)配位的雙組氨酸六配位結(jié)構(gòu)，如NGB結(jié)構(gòu)；中間是未被占位的五配位結(jié)構(gòu)，如HB或者M(jìn)B的結(jié)構(gòu)；右邊是與外源性配體O2與遠(yuǎn)端HisE7競(jìng)爭(zhēng)性綁定第六個(gè)配位鍵的六配位結(jié)構(gòu)。(Biochim Biophys Acta， 2015， 1850： 169-177)

1.1腦紅蛋白結(jié)構(gòu)

球蛋白可以分為五配位結(jié)構(gòu)與六配位結(jié)構(gòu)兩種。有一個(gè)組氨酸側(cè)鏈配體附著的含鐵血紅素蛋白分子被稱為五配位球蛋白，以紅細(xì)胞中的血紅蛋白和其他大多數(shù)氧轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為代表；有兩個(gè)組氨酸側(cè)鏈配體附著的含鐵血紅素蛋白分子被稱為六配位球蛋白，動(dòng)物體內(nèi)的腦紅蛋白、在高濃度有機(jī)溶劑或者低pH值情況下應(yīng)激轉(zhuǎn)化的人類血紅蛋白，以及植物體內(nèi)的非共生植物血紅蛋白(nonsymbiotic hemoglobins)等是六配位球蛋白[2]。MB是具有代表性的五配位結(jié)構(gòu)球蛋白：鐵被卟啉環(huán)上的四個(gè)氮原子與在肽鏈中第8位的近端組氨酸F螺旋上的一個(gè)氮原子(proximal histidine in the F helix，HisF8)綁定，形成五配位結(jié)構(gòu)。NGB是具有代表性的六配位結(jié)構(gòu)球蛋白。生理?xiàng)l件下，肽鏈會(huì)盤繞成球形，把血紅素分子緊密的包裹在里面，從而形成經(jīng)典的螺旋三明治夾心樣的球狀折疊結(jié)構(gòu)。鐵在與軸兩極等距的中緯線上與卟啉環(huán)上的四個(gè)氮原子和軸向上穩(wěn)定保守的近端HisF8協(xié)調(diào)配位。在缺少外源性結(jié)合配體的情況下，軸向上另一遠(yuǎn)端位點(diǎn)被內(nèi)源性殘留的配體通常是肽鏈中第7位的遠(yuǎn)端組氨酸E螺旋上的一個(gè)氮原子(the distal histidine in the E helix，HisE7)占位，從而形成雙組氨酸六配位結(jié)構(gòu)。通過(guò)X射線晶體學(xué)和光譜學(xué)的檢測(cè)也顯示出，NGB是一種遠(yuǎn)端HisE7占第6配位的雙組氨酸球蛋白[3]。因此，NGB與外源性配體如O2、CO、NO等發(fā)生結(jié)合時(shí)，首先要打破鐵和遠(yuǎn)端HisE7之間的紐帶，而后外源性配體才有可能與NGB結(jié)合。外源性配體與內(nèi)源性遠(yuǎn)端HisE7之間的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致了配體結(jié)合動(dòng)力學(xué)的復(fù)雜模式[4](圖1)。由于六配位球蛋白的遠(yuǎn)端HisE7相對(duì)容易發(fā)生結(jié)構(gòu)上的可逆改變，球蛋白在五配位的構(gòu)象上可以降低活性以保持相對(duì)穩(wěn)定，更好的應(yīng)對(duì)機(jī)體所需要的氧的運(yùn)輸?shù)壬锕δ埽虼怂袆?dòng)物的六配位球蛋白都可能是五配位球蛋白結(jié)構(gòu)的原始祖先狀態(tài)進(jìn)化演變而來(lái)[2]。

1.2腦紅蛋白的分布

NGB是一個(gè)具有150個(gè)氨基酸殘基的單體蛋白質(zhì)，主要分布在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)。應(yīng)用免疫印跡法在人類神經(jīng)干細(xì)胞中已檢測(cè)到有NGB的表達(dá)，從神經(jīng)干細(xì)胞到神經(jīng)細(xì)胞的進(jìn)一步分化都伴隨著NGB表達(dá)的不斷增加[5]。在魚類、兩棲類和鳥類的大腦中NGB也有表達(dá)，因此,NGB可能存在于所有的脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)[6]。高雪晉等[7]用免疫組織化學(xué)染色法，研究了NGB在西門塔爾牛中的分布。結(jié)果顯示：NGB在西門塔爾牛的神經(jīng)系統(tǒng)以及心臟、睪丸、子宮等多種組織細(xì)胞中均有分布。NGB雖然在機(jī)體中分布廣泛，但是其免疫組化染色顯示的陽(yáng)性表達(dá)卻有明顯的強(qiáng)度差異，腦紅蛋白表達(dá)的濃度變化取決于組織對(duì)氧的需求量[6]。NGB優(yōu)先駐留代謝活躍的細(xì)胞和亞細(xì)胞間隔，低氧分壓區(qū)通常沒(méi)有或較少存在NGB。此外，NGB濃度還與線粒體的分布密切相關(guān)，約有百分之十的NGB分布在線粒體中。這一觀察結(jié)果為NGB和氧化代謝之間的關(guān)聯(lián)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)[1]。大量研究表明，NGB已經(jīng)在腦腫瘤和非腦腫瘤中被檢測(cè)到。NGB 的mRNA和蛋白在大腦腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)的有：大鼠星形細(xì)胞瘤，人腦星形細(xì)胞瘤；在非腦組織腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的包括：非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞等[8]。免疫組織化學(xué)染色顯示腫瘤組織NGB表達(dá)高于相應(yīng)的正常組織[9]。

2　腦紅蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用與可能機(jī)制

2.1腦紅蛋白與腦缺血缺氧

在生理?xiàng)l件下，內(nèi)源性NGB是減輕缺血缺氧引起的腦損傷的神經(jīng)保護(hù)劑。研究表明，通過(guò)采用大鼠全腦缺血模型對(duì)海馬CA1區(qū)觀察發(fā)現(xiàn)，肢體缺血預(yù)處理(Limb ischemic preconditioning， LIP)使NGB表達(dá)明顯上調(diào)，保護(hù)神經(jīng)元免受缺血再灌注損傷,而在肢體缺血預(yù)處理(LIP)和大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle cerebral artery occlusion， MCAO)后， NGB陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量均在海馬、皮質(zhì)和下丘腦隨著再灌注時(shí)間增長(zhǎng)而增加。缺血預(yù)處理后NGB可減輕缺血和缺氧介導(dǎo)的腦損傷[10]。在小鼠大腦發(fā)育早期(Postnatal 0)，急性缺氧暴露使NGB表達(dá)上調(diào)。表明腦紅蛋白在小鼠大腦成熟過(guò)程中的早期階段參與未成熟的神經(jīng)元對(duì)于急性缺氧適應(yīng)的反應(yīng)[11]。在雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞的情況下，NGB陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)在大腦皮層增加而在海馬降低。這可能是由于不同的小鼠品系以及小鼠大腦皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元對(duì)于缺血缺氧的反應(yīng)不同。NGB在大腦海馬相比于大腦皮質(zhì)中對(duì)缺血缺氧的響應(yīng)可能會(huì)更快，持續(xù)時(shí)間可能更短[8]。長(zhǎng)時(shí)間慢性缺血缺氧可能通過(guò)NGB自氧化和泛素化促進(jìn)NGB的降解，因此長(zhǎng)期慢性的缺血缺氧NGB表達(dá)不上調(diào)[12]。NGB在腦缺血缺氧中的表達(dá)比較復(fù)雜，取決于多種因素。缺血缺氧誘導(dǎo)的NGB可能的調(diào)控機(jī)制：缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)是一種應(yīng)對(duì)缺氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。NGB的mRNA與HIF-1α依賴的靶基因在新生小鼠急性缺氧后均顯著上調(diào)，表明HIF-1α可能在缺血缺氧過(guò)程中參與NGB表達(dá)調(diào)控。HIF-1α可以被脯氨酰羥化酶(PDH)羥基化，在缺乏氧氣時(shí) PHD活性會(huì)隨著與其呈負(fù)相關(guān)的IKB激酶-β的激活而被抑制，導(dǎo)致HIF-1α積累和激活下游轉(zhuǎn)錄。在特異性蛋白(SP1)的啟動(dòng)子上，HIF-1α可以與其相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，刺激SP1在大鼠腦缺血缺氧后迅速轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠NGB基因核心近端啟動(dòng)子554 bp片段可能含有NF-κB(核因子-κB)、CREB(cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白質(zhì))和EGR1(早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1)的結(jié)合位點(diǎn)。超表達(dá)與敲除這些轉(zhuǎn)錄因子，分別增加和減少NGB表達(dá)。這表明NF-κB、CREB和EGR1通過(guò)與小鼠腦紅蛋白基因的啟動(dòng)子的特異性相互作用可以直接調(diào)節(jié)NGB表達(dá)。缺氧也可能通過(guò)其他機(jī)制如誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素(EPO)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等來(lái)誘導(dǎo)NGB表達(dá)上調(diào)。另外，NGB啟動(dòng)子的甲基化也可能是一個(gè)NGB表達(dá)于神經(jīng)元或大腦的調(diào)節(jié)機(jī)制[8]。

2.2腦紅蛋白的超表達(dá)

越來(lái)越多的研究表明，在通過(guò)轉(zhuǎn)基因等手段合成的外源性NGB的干預(yù)下使機(jī)體處于NGB超表達(dá)狀態(tài)時(shí)，對(duì)于清除活性氧物質(zhì)、減少一氧化氮損傷、神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的抵抗、創(chuàng)傷性腦損傷的保護(hù)等有著更為顯著的作用。

2.2.1腦紅蛋白超表達(dá)對(duì)于一氧化氮以及活性物質(zhì)的清除線粒體是腦卒中及相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病中神經(jīng)細(xì)胞存活和死亡的關(guān)鍵。活性氧(reactive oxygen species， ROS)是線粒體呼吸結(jié)束時(shí)的一部分電子通過(guò)復(fù)合物I和III向氧氣泄漏產(chǎn)生的，而NGB可以維持線粒體ATP的水平，減少ROS的產(chǎn)生，并參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號(hào)。NGB轉(zhuǎn)基因小鼠海馬在缺血再灌注后的ROS與活性氮(reactive nitrogen species， RNS)的產(chǎn)生相比于野生型小鼠明顯減少[13]。在NO處理后的野生型細(xì)胞和NGB轉(zhuǎn)染的HN 33細(xì)胞之間比較NO誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的敏感性可以發(fā)現(xiàn)，NGB超表達(dá)使?jié)舛榷拘郧€向右移動(dòng)，表明NGB可以降低對(duì)于NO誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的敏感性[14]。相同NO濃度下腦紅蛋白超表達(dá)的神經(jīng)元與野生型神經(jīng)元相比受到傷害較小，表明豐富的腦紅蛋白緩沖NO，提高NO介導(dǎo)神經(jīng)元損傷的閾值[15]。NGB清除ROS的機(jī)制可能是其64位點(diǎn)的組氨酸與ROS發(fā)生作用[14]或者與呼吸鏈組分之間的蛋白互作而清除ROS[13]。NGB和神經(jīng)元一氧化氮合酶(nNOS)的高度共定位已在前基底內(nèi)側(cè)杏仁核、外側(cè)下丘腦被檢測(cè)到，表明NO可以作為NGB的內(nèi)源性配體被直接綁定后清除[16]。

2.2.2腦紅蛋白超表達(dá)對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的影響氨基乙磺酸(Tau)的高度磷酸化是阿爾茲海默癥(AD)大腦的特征性病理標(biāo)志，超表達(dá)NGB可以在多個(gè)糖原合酶激酶(GSK-3β)控制的AD相關(guān)位點(diǎn)抑制Tau高度磷酸化。 NGB通過(guò)激活A(yù)kt信號(hào)來(lái)減少Tau蛋白的過(guò)度磷酸化意味著AD治療的又一標(biāo)靶[17]。在常氧和缺氧條件下，十二個(gè)月的NGB超表達(dá)小鼠在固定梁上行為測(cè)試的行走距離相比野生型小鼠更遠(yuǎn)。NGB在小鼠基底神經(jīng)節(jié)、大腦皮質(zhì)、海馬和小腦中表達(dá)較多。而這些大腦區(qū)域是容易受到與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如中風(fēng)和神經(jīng)退行性疾病的顯著影響。老化狀態(tài)的自由基理論認(rèn)為與年齡有關(guān)的氧化應(yīng)激的增加直接關(guān)系到與年齡有關(guān)的細(xì)胞功能下降[18]。因此， NGB超表達(dá)可以通過(guò)清除隨著年齡增加的活性氧，抵消年齡增大引起的神經(jīng)功能障礙。

2.2.3NGB超表達(dá)對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷的保護(hù)作用在大鼠局灶性腦損傷模型中，NGB的表達(dá)在損傷1h后急劇增加，6h后達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。中度與重度的腦損傷引起的NGB升高相比于輕度損傷較為顯著。NGB超表達(dá)轉(zhuǎn)基因(Ngb-Tg)小鼠與野生型 (WT)對(duì)照小鼠同時(shí)遭受到創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury TBI)后，NGB表達(dá)均顯著上調(diào)，而在TBI六小時(shí)后產(chǎn)生的氧化損傷生物標(biāo)志物3硝基絡(luò)氨酸(3-nitrotyrosine 3NT)在Ngb-Tg小鼠腦中相比與WT小鼠顯著降低，并且Ngb-Tg小鼠相比于與野生型小鼠，在TBI三周后的損傷性病灶體積明顯減小[19]。TBI后NGB起到顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，從而可能對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷治療及預(yù)后有重要意義。

3　展望

NGB是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)分子，在缺血缺氧，活性物質(zhì)的清除，相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及創(chuàng)傷性腦損傷中，尤其是在NGB超表達(dá)狀態(tài)，起到極其重要的神經(jīng)保護(hù)作用。隨著NGB越來(lái)越多的功能以及假設(shè)機(jī)制被進(jìn)一步闡明， NGB對(duì)大腦缺血缺氧，腦外傷，中風(fēng)和相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的神經(jīng)保護(hù)作用和靶向療法會(huì)被更深入的了解與應(yīng)用。

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[責(zé)任編輯李麥產(chǎn)]

Neuroprotective effects of neuroglobin

School of Life Science, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

Neuroglobin is a hexacoordinate heme monomer globulin, which is mainly expressed in the nervous system ,and it can be expressed in other organs and tissues. In cultured neurons and in vivo, the over-expression of neuroglobin can decrease the neural injury. In addition, previous studies have also showed that neuroglobin can serve as an endogenous neuroprotective molecule. Over-expression of neuroglobin in scavenging reactive oxygen species, reducing the damage caused by nitric oxide, reducing the incidence of neurodegenerative diseases, and the protection of traumatic brain injury are more prominent. However, the mechanism of its neuroprotective effect is not fully understood. In this article, the structure, distribution and neuroprotective functions of the neuroglobin are briefly introduced.

neuroglobin; hexacoordinate structures; neuroprotection

1672-7606(2016)03-0225-04

2016-07-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(31070952，U1204311)；河南大學(xué)省屬高?？蒲许?xiàng)目(0000A40475, 0000A40356)

李直(1985-)，男，河南開封人，在讀碩士生，從事生物醫(yī)學(xué)的學(xué)習(xí)和研究。

鄧錦波(1957-)，男，江西高安人，博士，教授，從事發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)的研究工作。

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