小鼠視網(wǎng)膜剝離及鋪片改良應(yīng)用于電生理學的研究

李瑞萍，孫儀征，范文娟，鄧錦波

河南大學生命科學學院 神經(jīng)生物學研究所，河南 開封 475004

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小鼠視網(wǎng)膜剝離及鋪片改良應(yīng)用于電生理學的研究

河南大學生命科學學院 神經(jīng)生物學研究所，河南 開封 475004

〔目的〕 改良小鼠視網(wǎng)膜剝離及鋪片方法，優(yōu)化組織學觀察及電生理學研究?！卜椒ā?選用C57BL/6J小鼠在立體顯微鏡下進行視網(wǎng)膜剝離鋪片，然后用免疫熒光和Dil散射標記對其效果進行評估。〔結(jié)果〕 改良后的方法能夠較好地進行視網(wǎng)膜剝離鋪片。用免疫熒光染色和Dil散射標記后，包括血管和神經(jīng)細胞在內(nèi)的許多組織學結(jié)構(gòu)都能非常形象地觀察到?！步Y(jié)論〕 經(jīng)過改良的視網(wǎng)膜鋪片技術(shù)能夠應(yīng)用于組織學觀察或電生理學研究。

視網(wǎng)膜剝離；鋪片；免疫熒光；Dil散射標記

視網(wǎng)膜(retina)是位于眼球最內(nèi)層的神經(jīng)組織，是一層透明的、非常薄又復雜的結(jié)構(gòu)。從胚胎發(fā)育來看，視網(wǎng)膜實際上是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，因其細胞類型簡單、分層清楚，而被用做研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能及信息傳遞和調(diào)控的理想模型[1]。在各種關(guān)于視網(wǎng)膜的研究中，常常要用到視網(wǎng)膜整體剝離和鋪片技術(shù)，但視網(wǎng)膜剝離鋪片操作較繁瑣、分離困難、鋪片難度較大[2]，尤其在小鼠這類眼球比較小的動物中對視網(wǎng)膜進行剝離鋪片更加困難。實踐過程中，我們摸索了一種比較成熟的視網(wǎng)膜剝離鋪片技術(shù)，為視網(wǎng)膜研究提供了更加方便、快捷的研究模型。

1　材料和方法

1.1實驗動物

C57BL/6J仔鼠，雌雄不限，出生當日計為生后0 d(postnatal day 0，P0)。本實驗選用P0～P30的小鼠作為實驗動物。動物喂養(yǎng)在標準環(huán)境下進行，室溫保持在20～26 ℃，相對濕度為55%～65%，房間內(nèi)定期消毒。按照自然晝夜節(jié)律采光，自由進食和飲水。小鼠飲用水選自實驗室自制的單蒸水，2～3 d更換一次墊料，并進行消毒。

1.2小鼠灌注固定

將小鼠經(jīng)腹腔注射體積分數(shù)為10%的水合氯醛麻醉后開胸解剖，使心臟暴露。灌注針插入左心室，同時剪開右心房引流灌流液。先用20 mL生理鹽水經(jīng)心灌流固定，至肝腸變白后，再用體積分數(shù)4%的多聚甲醛20～40 mL緩慢灌流固定。可發(fā)現(xiàn)小鼠全身抽搐，待抽搐完全停止，小鼠身體變硬后可停止灌注?；铙w觀察或電生理實驗，可省去灌注固定。

A.倒置顯微鏡下完整的視網(wǎng)膜形態(tài)，標尺=250 μm;B.視網(wǎng)膜整體鋪片血管分布(Collagen Ⅳ標記)，標尺=250 μm;C.視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞形態(tài)(Ibal標記)，示框內(nèi)是放大的單個小膠質(zhì)細胞，標尺=50 μm;D.Dil散射標記的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞，標尺=25 μm圖1　剝離后的視網(wǎng)膜及其組織學觀察

1.3視網(wǎng)膜的剝離

用解剖剪把固定后小鼠的眼瞼剪開，再用鑷子將眼球取出，放在盛有0.01 mol/L的PBS的培養(yǎng)皿中。在立體顯微鏡下，雙手持眼科鑷，左手夾住眼球的視神經(jīng)節(jié)端，右手用鑷子尖在另一端扎破角膜，然后用眼科剪交叉剪開角膜，用眼科鑷小心撕開相鄰兩瓣角膜(撕的過程中一定要小心，不要大幅度拉扯，以防視網(wǎng)膜破損)?？梢娋铙w、玻璃體、視網(wǎng)膜等完全暴露在視野中，用鑷子將晶狀體挑出，再用鑷子將視網(wǎng)膜外圍的一圈鞏膜分離下來，剝離出完整的視網(wǎng)膜。若視網(wǎng)膜上粘連有色素層，也需小心地將其分離。將凹狀的視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移到載玻片上，用吸水紙吸去周圍多余的水，用刀片在視網(wǎng)膜上對稱地切成四瓣，呈“十”字花形，以便視網(wǎng)膜的展開和鋪片。最后，將視網(wǎng)膜放在體積分數(shù)為4%的多聚甲醛EP管中，4 ℃冰箱固定2 h，待用[3]。

1.4免疫熒光標記視網(wǎng)膜細胞

膠原蛋白Ⅳ(collagen，Ⅳ)是由血管內(nèi)皮細胞分泌的基底層的一部分，為了有效顯示血管的基膜，我們采用兔抗Collagen Ⅳ多克隆抗體(1∶200，Abcam公司，ab6586)染色[4]；利用Iba1特異性地標記小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞[5]。兔抗Iba1單克隆抗體(1∶200，Abcam公司，ab108539)用于本實驗。固定好的視網(wǎng)膜取出后，用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次15 min。將視網(wǎng)膜放入 EP 管中，加入適量的一抗工作液 4 ℃孵育2～3 d。用0.01 mol/L的PBS洗3次，再加相應(yīng)的二抗4 ℃避光孵育1 d。對應(yīng)二抗為：Alexa568驢抗兔IgG(1∶600，Invitrog，A10042)。經(jīng)0.01 mol/L的PBS洗3次后，對視網(wǎng)膜鋪片。用毛筆小心地將視網(wǎng)膜平鋪在干凈的載玻片上，滴加質(zhì)量分數(shù)為65%的DAPI甘油，加蓋蓋玻片，封固四周，熒光顯微鏡觀察拍照[6]。

1.5Dil散射標記

將上述視網(wǎng)膜取出后用0.1 mol/L的PB洗3次，每次15 min。將視網(wǎng)膜放入6孔板中，每孔1～3片，放到孔中央，吸掉多余的緩沖液，使切片處于欲干未干狀態(tài)。將Dil-金顆粒彈頭放在基因槍內(nèi)，在氦氣(150～180 P.S.i.)下，將Dil-金顆粒散射到視網(wǎng)膜表面。在熒光立體顯微鏡下檢查Dil標記密度，如果密度低，可以再散射一次，直到Dil密度滿意為止[7]。經(jīng)散射后的視網(wǎng)膜用0.1 mol/L的PB洗3次，最后保留在PB中，放在4 ℃，孵育12～24 h。用甘油封片，觀察[8]。

2　結(jié)果

將剝離好的視網(wǎng)膜放在倒置顯微鏡下觀察拍照(圖1A)，可觀察到視網(wǎng)膜的完整形態(tài)，便于繼續(xù)對視網(wǎng)膜進行染色、研究。將視網(wǎng)膜整體鋪片Collagen IV抗體免疫熒光后，在熒光顯微鏡下可觀察到完整的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)(圖1B)。視網(wǎng)膜血管形態(tài)清晰可見，毛細血管呈網(wǎng)狀均勻分布于整個視網(wǎng)膜。用Iba1抗體做免疫熒光染色來檢測小鼠視網(wǎng)膜的小膠質(zhì)細胞，可以看到小膠質(zhì)細胞均勻分布于整個視網(wǎng)膜。小膠質(zhì)細胞的細胞體呈細長或橢圓，從胞體發(fā)出細長而有分支的突起(圖1C)。將視網(wǎng)膜Dil散射標記后，可觀察到Dil金顆粒均勻分散在整個視網(wǎng)膜上。DiI標記后的細胞有許多突起，在高倍鏡下可以清楚地觀察到突起的小樹突棘(圖1D)。

3　討論

視網(wǎng)膜剝離鋪片技術(shù)可以對視網(wǎng)膜細胞進行完整的觀察研究，可用于視網(wǎng)膜形態(tài)學觀察或電生理研究。但由于操作較繁瑣、分離困難、展片難度較大、固定時間不易掌握等原因，如處理不當容易導致視網(wǎng)膜殘缺，且組織學結(jié)構(gòu)也不完整，直接影響了對實驗結(jié)果的觀察與分析。我們改進的視網(wǎng)膜剝離鋪片技術(shù)避免了這些技術(shù)上的缺點, 既可觀察細胞形態(tài)，也能作電生理分析。

實驗中，我們選取P0～P30的小鼠作為實驗動物。在幼鼠和成鼠的眼球中，存在著一些差別。幼鼠的眼球很小，環(huán)繞著整個晶狀體，并與晶狀體相連，所以分離時要小心，并且幼鼠視網(wǎng)膜很軟，在固定視網(wǎng)膜時時間要相對長一些。成鼠的眼球相對較大，容易剝離，但是視網(wǎng)膜易于色素層粘連，所以，在灌注的時候要把眼球固定好，剝離時就容易分離。

本實驗通過對視網(wǎng)膜剝離鋪片操作技術(shù)的反復實驗、改進和分析，總結(jié)有以下技巧：①小鼠的心臟灌流時，穿刺位置要準確，并準確剪切右心房以便灌流液順利流出，注意剪切口不要太大，否則壓力過小不易固定。灌注體積分數(shù)4%多聚甲醛時一定要緩慢進行，否則眼球固定不好，晶狀體較軟，視網(wǎng)膜不易剝離。②剝離視網(wǎng)膜時一定要小心，視網(wǎng)膜位于眼球壁的內(nèi)層，組織比較薄，而且附著在色素層上，剝離過程中很容易破碎。因此，去除晶狀體后，將眼球壁剪開成若干等份，輕輕剝離出視網(wǎng)膜。③剪切視網(wǎng)膜時，視網(wǎng)膜在載玻片上容易卷曲，先用刀片在兩邊切開，用毛筆輕輕刷開視網(wǎng)膜，然后在另外兩邊切開視網(wǎng)膜，使呈“十”字形。注意毛筆一定要用清水沖洗一下，避免粘上雜質(zhì)，影響后面實驗結(jié)果。④固定時間要掌握好。一般成年小鼠固定1～2 h，幼鼠固定2～3 h。時間太短，達不到固定效果；時間太久，視網(wǎng)膜容易脆，不利于之后的實驗操作。⑤實驗過程中用到的PBS緩沖液和多聚甲醛固定液最好是新鮮配制的，放置時間最好不要超過1 mon。

經(jīng)過這樣改良的視網(wǎng)膜剝離鋪片技術(shù)，可得到完整的視網(wǎng)膜形態(tài)，在進行形態(tài)學觀察或電生理研究時，細胞形態(tài)好，視網(wǎng)膜不易破碎。

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[責任編輯時紅]

The detachment and stretched slice of mouse-retina

Institute of Neurobiology, School of Life Science, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕We tried to improve the methods of retinal detachment and stretched slice in mice. 〔Methods〕The C57BL/6J mice were utilized to detach mouse retina and to prepare retina-stretched slice under dissection microscope, and in the meantime, the effects were evaluated with immunofluorescent labeling and Dil diolistic assay. 〔Results〕The modified methods can be used to detach retina and prepare stretched slice with satisfied results. With immunofluorescent labeling and Dil diolistic assay, the histological structure, including the vessels and neurons, could be visualized well. 〔Conclusion〕The detached and stretched retina can be applied in the researches of histology and electrophysiology.

retinal detachment; stretched slic; immunofluorescent labeling; Dil diolistic assay

1672-7606(2016)03-0189-03

2015-11-17

河南省自然科學基金(12B180017)；河南大學省屬高?？蒲许椖?0000A40475, 0000A40356)

李瑞萍(1992-)，女，河南開封人，河南大學在讀碩士生，從事生物醫(yī)學的學習和研究。

鄧錦波(1957-)，男，江西高安人，博士，教授，從事發(fā)育神經(jīng)生物學的研究工作。

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