杜仲保健酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

寇 威，王景春，王 偉 ，徐燕茹，王凌云，李 欽

1. 河南大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004

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杜仲保健酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

1. 河南大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475000； 2. 河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004

〔目的〕 研究杜仲保健酒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?！卜椒ā?對杜仲保健酒的含醇量、總固體量、有毒物質(zhì)進(jìn)行了檢測；采用TLC法對杜仲酒中西洋參和枸杞進(jìn)行了定性分析；采用HPLC法對杜仲皮主要成分松脂醇二葡萄糖苷的含量進(jìn)行了測定，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱，流動相為甲醇-水(21∶79)，流速為1.0 mL∕min。檢測波長為277 nm，檢測溫度為25 ℃，進(jìn)樣量為50 μL?！步Y(jié)果〕 TLC色譜特征明顯，專屬性強(qiáng)；松脂醇二葡萄糖苷在0.053 4～0.534 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7)，平均回收率為96.756%，RSD為2.3%(n=6)?！步Y(jié)論〕 該方法簡單準(zhǔn)確，可作為該杜仲保健酒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

杜仲酒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

杜仲(Eucommia ulmoides)為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的干燥樹皮，是我國名貴滋補(bǔ)藥材，具有降血壓、補(bǔ)肝益腎、利尿、安胎等作用[1]。杜仲保健酒是由干燥杜仲皮、西洋參、枸杞、大棗、山藥五味中藥泡制而成，具有調(diào)節(jié)血壓、降低血脂、滋陰補(bǔ)腎、強(qiáng)身健體、增強(qiáng)免疫力等功效。為了保證杜仲保健酒的質(zhì)量，我們采用TLC法對西洋參、枸杞子進(jìn)行了定性鑒別，采用HPLC法測定該品君藥杜仲皮有效成分松脂醇二葡萄糖苷的含量。

1　儀器與藥品

1.1儀器

Agilent 1260 infinity 高效液相色譜儀(美國安捷倫)；D-S AB135-S電子分析天平(METTLER TOLEDO公司)；01-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、展開缸。

1.2藥品

枸杞子對照品；人參皂苷Rb1、Rg1、Re對照品和松脂醇二葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(均由中國藥品生物制品檢定所提供)；硅膠G(為青島海洋化工廠產(chǎn)品)；醋酸乙酯、乙醇、甲苯、甲酸、三氯甲烷、硫酸、正丁醇分析純；純水。

2　方法與結(jié)果[2]

2.1含醇量(酒精度)

分別從四批樣品中各精密量取100 mL(共400 mL)酒液，置于500 mL蒸餾瓶中，水浴蒸餾；收集40 mL濾液并加蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻倒置干凈燒杯中，靜置3 min；放入酒精計和溫度計，分別測量含醇量和溫度，換算成20 ℃時的含醇量即得酒精度。四批酒樣的平均酒精度為40.8%。

2.2總固體

分別從四批樣品中各取30 mL酒液于干燥蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后放入干燥箱中110 ℃干燥40 min，精密稱重，即得干燥恒重后的總固體量。四批樣品的平均總固體量為0.938 2 g/mL。

2.3有毒物質(zhì)的鑒定

2.3.1甲醇檢查精密量取酒液3 mL，加水定容至100 mL，取1 mL作為供試品溶液；精密稱取甲醇10 mL，加水定容至100 mL，取1 mL作為對照品溶液。將兩者均加水至5 mL，向兩者中各加2 mL高錳酸鉀-磷酸溶液，搖勻放置10 min；各加入2 mL草酸-硫酸溶液，混勻使之褪色，再加入5 mL品紅-亞硫酸溶液，混勻。二者顏色對比，供試品比對照品顏色淺，符合規(guī)定，甲醇含量≤0.03%。

2.3.2雜醇油的檢查取酒液10 mL，加5 mL水和10 mL甘油，搖勻后分次滴加在無溴濾紙上，使乙醇自然揮發(fā)。始終聞異臭，符合規(guī)定，雜醇油含量≤0.2%。

2.3.3鉛鹽的檢查取酒液10 mL，加5 mL NaOH溶液和10 mL水，溶解后置鈉氏比色管中，加5滴硫化鈉試液。與同樣處理后的10 mL鉛溶液進(jìn)行顏色比較，顏色較對照液淺，符合規(guī)定，鉛含量≤1 mg/L。

2.4西洋參的鑒別

取酒液，90 ℃水浴加熱，蒸至無醇味，加20 mL水，用25 mL正丁醇分別振搖提取2次；合并正丁醇提取液，每次10 mL水洗滌2次，分別取正丁醇液水裕加熱蒸干。殘渣加4 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

取1 g西洋參，量取25 mL甲醇加入，然后加熱回流40 min，過濾并將濾液蒸干，殘渣加20 mL水溶解。每次用25 mL正丁醇分別振搖提取2次，留取正丁醇提取液并合并，加水洗滌2次，每次10 mL；分別留取正丁醇液水浴加熱至蒸干。殘渣加4 mL甲醇溶解，即為對照藥材溶液。

分別精密量取人參皂苷Rb1、Rg1、Re對照品各2 mg，并加入6 mL甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液。

分別吸取上述各溶液5 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，以水-甲醇-乙酸乙酯-三氯甲烷(10∶22∶40∶15)20 mL為展開劑上行展開。展距為8 cm，噴以體積分?jǐn)?shù)為10%硫酸乙醇溶液，110 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，在365 nm紫外燈下檢視[3-4]，結(jié)果見圖1。

圖1　西洋參TLC圖

2.5枸杞薄層鑒別

取酒液50 mL，水浴加熱蒸至無醇味，加入20 mL水，用20 mL乙酸乙酯分別提取2次；合并乙酸乙酯提取液，置水浴上蒸干。殘渣加1 mL乙醇溶解，作為供試品溶液。

取枸杞藥材0.5 g，加30 mL水煎煮30 min過濾，濾液每次用20 mL乙酸乙酯分別提取2次；合并乙酸乙酯提取液，置水浴上蒸干。殘渣加1 mL乙醇溶解，作為對照品溶液。

吸取上述各溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15∶8∶1.5)12 mL為展開劑，在展開缸上行展開。展距為8 cm，置365 nm紫外燈下檢視[5]，結(jié)果見圖2。

圖2　枸杞TLC圖

2.6松脂醇二葡萄糖苷含量測定[1,6-8]

表1　松脂醇二葡萄糖苷回收率實驗(n=6)

2.6.1對照品溶液的制備精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對照品5.34 mg，用體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，制成每1 mL含松脂醇二葡萄糖苷0.053 4 mg的對照品溶液。

2.6.2供試品溶液的制備量取10 mL酒液，置于分液漏斗中，分別用20，15，15 mL氯仿萃取3次；棄去氯仿液合并上層液，置于水浴加熱蒸干；殘渣加5 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，經(jīng)0.45醋酸纖維素膜過濾，取濾液，得供試品溶液。

2.6.3色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗色譜柱Thermo Hypersil Gold C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) ；以甲醇、水(21∶79)為流動相；流速1.0 mL/min，檢測波長277 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量50 μL。

2.6.4線性關(guān)系的考察分別精密吸取對照品溶液5，10，20，30，40，50 μL，注入液相色譜儀，測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

y=338.68x+2.0575，

R2=0.9997。

表明松脂醇二葡萄糖苷線性關(guān)系良好。

2.6.5精密度實驗精密吸取同一供試品溶液測定6次，進(jìn)樣50 μL，測定，其峰面積RSD為1.023%(n=6)實驗結(jié)果表明，精密度良好。

2.6.6穩(wěn)定性實驗分別于配制后的0，2，4，12，24，48 h精密吸取供試品溶液50 μL，注入液相色譜儀，測定，松脂醇二葡萄糖苷峰面積RSD為0.52%。結(jié)果表明，供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.7重復(fù)性實驗取同一批樣品(批號：2014125)，依法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣量為50 μL，依法測定并計算，結(jié)果平均含量為0.187 6 mg/mL，RSD為1.023%(n=6)，表明此法重復(fù)性較好。

2.6.8加樣回收率試驗精密稱取已知含量的樣品(批號：2014125)5 mL，置10 mL量瓶中，精密加入對照品溶液(見第2.6.1節(jié))5.0 mL，搖勻。依法測定，平均回收率為96.756%，RSD為2.304%，結(jié)果見表1。

2.6.9樣品測定取不同批號(2014123，2014124，2014125，2012126，2014127，20131121，20131226)的樣品，依法測定，結(jié)果見表2。

表2　松脂醇二葡萄糖苷含量測定結(jié)果

2.6.10對照品和供試品溶液的高效液相色譜圖對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照溶液，分別精密量取50 μL的溶液，注入色譜儀，得到高效液相色譜圖，見圖3、圖4、圖5。

圖3　松脂醇二葡萄糖苷對照品HPLC圖

圖4　杜仲保健酒松脂醇二葡萄糖苷HPLC圖

圖5　杜仲保健酒松脂醇二葡萄糖苷陰性對照液HPLC圖

3　討論

采用TLC法對杜仲酒中西洋參和枸杞進(jìn)行了定性分析，分離度高、專屬性強(qiáng)。在中國藥典2010 年版中，杜仲藥材的定性鑒別仍為外觀性狀及顯微鑒別，這種鑒別方法對于完整的杜仲藥材來說是可行的，但對于粉末狀藥材或藥材提取物等來說就不適應(yīng)[9]。

杜仲皮的成分主要是松脂醇二葡萄糖苷，因此我們采用HPLC法測定杜仲保健酒中松脂醇二葡萄糖苷的含量，比較了甲醇、水(25∶75 V/V)，甲醇、水(21∶79 V/V)為流動相進(jìn)行試驗。結(jié)果表明，以甲醇、水(21∶79 V/V)作為流動相、流速為1.0 mL/min、檢測波長為277 nm時，供試品色譜中待測峰保留時間適中，峰形對稱，且與雜質(zhì)峰有較好的分離。試驗方法簡單準(zhǔn)確，為該杜仲保健酒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了相關(guān)依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典( 一部)[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:80.

[2] 毛維倫. 蘆薈酒劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 湖北中醫(yī)雜志，1998,20(3):55-57.

[3] 黃秋香. 西洋參薄層色譜鑒別方法改進(jìn)[J]. 中藥材，2002,25 (3):172-173.

[4] 王彤. 洋參膏中西洋參的薄層層析定性鑒別[J]. 中醫(yī)函授通訊，1998,17 (6):39.

[5] 楊國紅. 參茸三腎酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J]. 中草藥，1994,25(9):457-458.

[6] 張倩茹. HPLC法測定杜仲及其相關(guān)制劑中松脂醇二葡萄糖苷的含量[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院報，2009,32(4):338-340.

[7] 陳龍富. HPLC測定天麻鉤藤飲中松脂醇二葡萄糖苷的含量[J]. 貴州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012,34(2):137-139.

[8] 王月茹. HPLC測定杜仲中松脂醇二葡萄糖苷的含量[J]. 現(xiàn)代中醫(yī)藥，2009,29(6):78-79.

[9] 劉玲，鮑家科. 杜仲藥材薄層色譜鑒別研究[J]. 中國民族民間醫(yī)藥2014,23(2):8-9.

[責(zé)任編輯李武營]

Study on quality standard of Eucommia health wine

1. The First Affiliated Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475000, China; 2. Pharmaceutial College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕To study the quality standard of eucommia ulmoides health wine. 〔Methods〕The Eucommia health wine alcohol content, total solids, toxic substances were detected; using TLC method of eucommia ulmoides in American ginseng wine and Chinese wolfberry has carried on the qualitative analysis; By the method of HPLC, eucommia bark skin the content of main components of rosin alcohol two glycosidase were determined, the chromatographic column for Agilent Eclipse XDB-C18 column, mobile phase of methanol and water (when), flow rate is 1.0 mL/min, detection wavelength is 277 nm, the testing temperature is 25 ℃, sample amount to 50μL . 〔Results〕he TLC chromatography characteristics, specificity is strong; Rosin alcohol two glycosidase inside the scope of 0.0534 to 0.534 ug sex good (r=0.999 7), the average recovery was 96.756%, RSD was 2.3% (n=6).〔Conclusion〕the method is simple and accurate, and can be used as the quality control standard of eucommia ulmoides health wine.

Eucommia wine; quality wtandard; TLC; HPLC

1672-7606(2016)03-0178-04

2015-11-17

國家公益性行業(yè)專項“杜仲育種群體建立與綜合利用技術(shù)研究”。

寇威(1983-)，女，河南開封人，主管藥師，中藥學(xué)碩士，從事中藥質(zhì)量控制方法的研究工作。

李欽(1965-)，男，河南開封人，中藥學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，教授，從事中藥學(xué)的教學(xué)與科研工作。

R927.2

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