若羌灰棗多糖提取工藝優(yōu)化研究

魏金鳳，賈玉華，閆 靜，曹鵬然,2，雷璐倩，胡志宇，康文藝,2

1. 河南大學 中藥研究所，河南 開封 475004； 2. 開封市保健食品功效成分研究重點實驗室，河南 開封 475004； 3. 河南大學 民生學院，河南 開封 475004

?

若羌灰棗多糖提取工藝優(yōu)化研究

1. 河南大學 中藥研究所，河南 開封 475004； 2. 開封市保健食品功效成分研究重點實驗室，河南 開封 475004； 3. 河南大學 民生學院，河南 開封 475004

〔目的〕 利用響應(yīng)面分析法對新疆若羌灰棗多糖的提取進行優(yōu)化，考察提取溫度、時間、液料比對多糖提取率的影響?！卜椒ā?在單因素試驗的基礎(chǔ)上選取試驗因素與水平，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，確定其最佳提取工藝條件為：提取時間1.68 h，提取溫度78.27 ℃，液料比27.36∶1?！步Y(jié)果〕 在此最佳工藝條件下，棗多糖的提取率可達71.19%。〔結(jié)論〕 在此基礎(chǔ)上采用Sevage法除去棗多糖溶液中蛋白質(zhì)，在樣品、Sevage為1∶1，氯仿、正丁醇為4∶1的條件下，研究萃取次數(shù)對蛋白質(zhì)和多糖的影響，得出最佳萃取次數(shù)為6次。

多糖提??；響應(yīng)面分析；脫蛋白

大棗(ZiziphusJujubaMill.)為鼠李科棗屬植物，原產(chǎn)于中國，迄今為止已有4000多年的歷史，在中國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了700多個品種[1]。棗中含有三萜類、皂苷類、生物堿類、維生素類、酰胺類、核苷類、糖類、黃酮類、糖苷類、蛋白質(zhì)、氨基酸類、有機酸類、 甾體類等化學成分[2]。其中，多糖含量最多，鮮果中的含糖量在40%以上，干果中的含糖量在 81.3%～88.7%[3]。大棗多糖具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老等[4]。在食品工業(yè)中的應(yīng)用也十分廣泛，如改善食品的質(zhì)地、形狀、外觀、口感、稠度等，可作功能性食品的開發(fā)，用作增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等，具有廣闊的市場和應(yīng)用前景。多糖的提取尤為關(guān)鍵，是其廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)。為進一步分離純化、鑒定結(jié)構(gòu)、揭示其藥理作用及食用價值，我們以若羌灰棗為研究對象，考察提取溫度、時間、液料比對多糖提取率的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新疆若羌灰棗，2016年1月購于開封市三毛超市；葡萄糖，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、濃硫酸(分析純) ，開封東大化工有限公司試劑廠；苯酚(分析純) ，天津基準化學試劑有限公司；石油醚(分析純)，天津市富宇精細化工有限公司；考馬斯亮藍G-250染料(SERVA) ，Electrophoresis GmbH公司；85%的磷酸(分析純) ，天津市福晨化學試劑廠；牛血清白蛋白(BSA)，成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

5%的苯酚溶液的配置：稱取苯酚5 g，加蒸餾水95 mL溶解，存放于棕色試劑瓶備用。

考馬斯亮藍G-250的配置：稱取50 mg考馬斯亮藍G-250，用90%的乙醇25 mL溶解，加入85%的磷酸50 mL，最后用蒸餾水定容到500 mL。

牛血清白蛋白標準溶液的配置：稱取10 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸餾水中，即為0.1 mg/mL的標準液。

1.2儀器與設(shè)備

電熱鼓風干燥箱(上海—恒科學儀器有限公司)；多功能粉碎機(鉑歐五金廠)；電子天平(梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)；電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；循環(huán)水式真空泵(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000B(鄭州國瑞儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA,東京理化器械株式會社)；TGL-22臺式高速冷凍離心機(四川蜀科儀器有限公司)；全波長酶標儀(梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)。

1.3多糖的提取

1.3.1原料前處理清水洗凈、去除棗核，烘干后粉碎后過60目篩。石油醚回流脫脂2 h，減壓抽濾，揮干石油醚，棗粉備用。

1.3.2葡萄糖標準曲線的繪制稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖41 mg，置于50 mL容量瓶中，定容，搖勻。分別吸取葡萄糖標準溶液0，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，用蒸餾水定容至2.0 mL，加入5%的苯酚溶液1 mL搖勻。吸取5 mL濃硫酸加入試管中，靜止10 min，搖勻，40 ℃水浴20 min，于490 nm處測定吸光度。繪制標準曲線，計算回歸方程，如圖1所示。

圖1　葡萄糖標準曲線

1.3.3試驗方法稱取2.000 g大棗粉末，熱水浸提后減壓抽濾，取濾液濃縮至10 mL置于具塞試管中。加入4倍無水乙醇，搖勻，3 000 r/min離心10 min，取沉淀用蒸餾水復(fù)溶，定容于100 mL容量瓶中。按1.3.2測定吸光度，每次重復(fù)3次，結(jié)果以平均值計算。

1.3.4單因素試驗設(shè)計以新疆若羌灰棗多糖提取得率為指標，分別考察提取溫度、液料比、提取時間對多糖提取率的影響[4-5]。

1.3.5響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、時間、液固比為自變量，運用Design Expert軟件按照Box-Behnken設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)曲面法分析，并對數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析，建立二次響應(yīng)回歸模型，擬合二次回歸方程，得到傳統(tǒng)熱水浸提法提取多糖的最佳工藝參數(shù)[6]。實驗設(shè)計方案見表1。

表1　響應(yīng)面分析因素與水平

1.4多糖的Sevage除蛋白

1.4.1樣品溶液的配置精確稱取提取的粗多糖0.503 6 g，用蒸餾水定容置于100 mL容量瓶中，形成終濃度為5 mg/mL多糖溶液。

1.4.2蛋白質(zhì)標準曲線的繪制取6支10 mL具塞試管，分別加0.1 mg/mL標準蛋白液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，蒸餾水定容至1.0 mL，加入考馬斯亮藍G-250試劑5 mL。蓋塞混合均勻，放置2 min后在595 nm波長下測定吸光度，繪制標準曲線，如圖2所示。

圖2　牛血清白蛋白標準曲線

1.4.3樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定取3支10 mL具塞試管，分別加入1.0 mL待測樣品和5 mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻。放置2 min后，在595 nm波長下測定吸光度，計算待測樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量。

1.4.4Sevage法脫蛋白取10 mL Sevage試劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)和10 mL粗多糖樣液，混合后劇烈振搖15～20 min，4 000 r/min離心10 min，靜置5 min。取上層水相溶液，定容到10 mL，測定其中糖、蛋白質(zhì)含量。取8份樣品，分別處理1，2，3，4，5，6，7，8次，每份樣品重復(fù)3次。

1.5計算

式中：c為樣品濃度，mg/mL；V為溶解樣品體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；F為測吸光度時吸取體積倍數(shù)； m為稱取樣品質(zhì)量，g；1 000為單位換算。

式中：m0為原樣液中蛋白質(zhì)量；m1為脫蛋白后樣液中蛋白質(zhì)量。

式中：M1為脫蛋白后樣液中多糖質(zhì)量；M0為原樣液中多糖質(zhì)量。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1溫度對多糖提取率的影響固定浸提時間為1.5 h，液料比25∶1，考察溫度對食用灰棗多糖提取率的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3　溫度對多糖提取率的影響

由圖3可知,隨著溫度的升高，多糖的提取率先增加后降低；當溫度為80℃時，多糖提取率最高；之后，可能由于溫度過高引起多糖結(jié)構(gòu)破壞而發(fā)生降解。故推測最佳提取溫度為80 ℃。

2.1.2液料比對提取率的影響固定浸提溫度為80 ℃，時間為1.5 h，考察液固比對食用棗多糖提取率的影響。結(jié)果如圖4所示。

圖4　液固比對多糖提取率的影響

由圖4可知,提取率隨著液固比的增大而逐漸增大；但當液固比增大到25∶1后，提取率逐漸趨于穩(wěn)定，液固比不再對提取率有大的影響。故液固比為25∶1時提取效果最好。

2.1.3提取時間對提取率的影響固定浸提溫度80 ℃，液固比為25∶1，考察提取時間對新疆若羌灰棗多糖提取率的影響。結(jié)果如圖5所示。

圖5　時間對多糖提取率的影響

由圖5可知,在0.5～1.5 h內(nèi)隨著時間的增加，提取率逐漸增加；在1.5 h后提取率下降，原因可能是加熱時間長造成多糖結(jié)構(gòu)破壞降解，且其他雜質(zhì)不斷溶出，使多糖提取率下降。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果,如表2所示。

表2　響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果

2.2.1方差分析與顯著性檢驗利用軟件對試驗結(jié)果進行二次多項式回歸擬合。對表2中的數(shù)據(jù)進行方差分析，得到模型的二次多項式回歸方程：

提取率=70.11-2.30 A+2.00 B+2.23 C-

0.34 A B-0.98 A C+0.95 B C-

8.30 A2-3.52 B2-2.91 C2。

對該模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3　方差分析與顯著性檢驗

由表3可以看出，回歸模型的F=71.12，P<0.000 1，表明試驗所采用的二次模型極顯著。模型可靠，對響應(yīng)值擬合良好。

另外，一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2，即溫度、時間、液固比對試驗結(jié)果的影響極顯著，而各因素交互項A B、A C、B C，即溫度、時間和液固比之間交互作用對試驗結(jié)果的影響不顯著。

2.2.2響應(yīng)面分析與優(yōu)化根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖，分析溫度、時間和液固比及其交互作用對新疆若羌灰棗多糖提取率的影響。

圖6為液固比為25∶1時，溫度與時間的交互作用對提取率影響的響應(yīng)曲面。由圖可知：溫度為70～90 ℃時提取率先增大后減小，溫度為80 ℃時達到最大；時間為1～2 h時提取率先增大后減小，時間為1.6 h時達到最大。

圖6　提取溫度與提取時間的交互作用

圖7為時間在1.5 h時，溫度與液固比的交互作用對提取率影響的響應(yīng)曲面。由圖可知：溫度為70～90 ℃時提取率先增大后減小，溫度為80 ℃時達到最大；液固比在20∶1～30∶1時提取率先增大后減小，液固比為26∶1時達到最大。

圖7　提取溫度與液固比的交互作用

圖8為溫度為80 ℃時，時間與液固比的交互作用對提取率影響的響應(yīng)曲面。由圖可知：時間為1～2 h時提取率先增大后減小，時間為1.6 h時達到最大；液固比在20∶1～30∶1時提取率先增大后減小，液固比為26∶1時達到最大。

圖8　提取時間與液固比的交互作用

2.3Sevage脫蛋白結(jié)果

通過牛血清白蛋白標準曲線(圖2)計算得到新疆若羌灰棗粗多糖中蛋白質(zhì)含量為28.320.4 mg/g。圖9為Sevage脫蛋白結(jié)果。

圖9　Sevage脫蛋白結(jié)果

由圖9可知,隨著萃取次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)脫除率會增加，多糖保留率會降低。這是因為Sevage除去蛋白質(zhì)的同時，不可避免地會溶解部分多糖。另外與蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白聚糖和糖蛋白也會沉淀下來；同時萃取次數(shù)越多在分離糖液與蛋白質(zhì)層時造成多糖的損失也越多。當萃取6次后，蛋白質(zhì)脫除率趨于平穩(wěn)，而多糖保留率還在逐漸減少，所以萃取6次為最佳次數(shù)。

3　結(jié)論

通過Design-Expert.8.05b軟件對優(yōu)化后的回歸方程分析可得，多糖的最佳提取工藝條件為：溫度78.27 ℃，時間1.68 h，液固比27.36∶1。在此最佳工藝條件下，新疆若羌灰棗多糖的最大提取率為71.19%。另外，Sevage法除多糖溶液中蛋白質(zhì)的最佳萃取次數(shù)為6次。

4　討論與展望

目前，多糖的提取方法有熱水浸提法、酶提取法、超聲輔助法和微波輔助法；脫蛋白的方法有sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法。熱水浸提操作簡單、實用、成本低，適用于大量提取多糖。影響提取效率的因素有提取溫度、提取時間、液固比等。一般溫度升高提取率高，但當溫度升到一定程度時，多糖結(jié)構(gòu)會破壞而導(dǎo)致提取率降低。同樣，提取時間延長提取率增加，但當多糖完全溶出后繼續(xù)提取會導(dǎo)致其他物質(zhì)的溶出而降低提取率。另一個重要因素是液固比即水的用量：用量小，多糖會存留在大棗中；用量大，會給后期濃縮帶來負擔。因此，控制好提取溫度、時間、和液固比對提取率的提高有很大影響。酶提取法、超聲輔助法和微波輔助法雖快速、安全、簡便，但成本高不適用于提取大量多糖。Sevage脫蛋白操作簡單、溫度低，能有效防止多糖降解，需要重復(fù)多次。重復(fù)次數(shù)少，蛋白質(zhì)去除不干凈，重復(fù)次數(shù)太多，會導(dǎo)致多糖損失嚴重和浪費試劑。因此，確定萃取次數(shù)對Sevage脫蛋白十分重要。在今后多糖的提取研究中，注重操作過程快速、安全、簡便的同時降低成本，使現(xiàn)有的提取工藝進一步完善，與實際生產(chǎn)接軌，利于多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] Gao Qinghan, Wu Chunsen, Wang Min. The jujube (ZiziphusJujuba Mill.) fruit: a review of current knowledge of fruit composition and health benefits[J]. Journal of agricultural and food chemistry. 2013,61:3351-3363.

[2] 劉世軍，唐志書，崔春利，等. 大棗化學成分的研究進展[J]. 云南中醫(yī)學院學報，2015,38(3):96-98.

[3] 陳熹，李玉潔，楊慶，等. 大棗現(xiàn)代研究開發(fā)進展與展望[J]. 世界科學技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015,17(3):687-690.

[4] 陳曉青，蔣新宇，劉佳佳. 中草藥成分分離分析技術(shù)與方法[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2006:210.

[5]馮艷波. 阿拉爾駿棗多糖的提取及其生物活性研究[D]. 新疆：塔里木大學，2014.

[6] 張俐勤，陶昆，范建奇，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化荸薺皮保鮮物質(zhì)微波提取工藝[J]. 保鮮與加工，2016,16(1):44-48.

[責任編輯李麥產(chǎn)]

Optimization of Extraction Process of polysaccharides from Ruoqiang grey jujube

1. Institute of Chinese Materia Medica, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 2. Kaifeng Key Laboratory of functional components in health food, Henan Kaifeng 475004, China; 3. Minsheng College, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕This paper aimed at optimization of the extraction of Ruoqiang grey jujube polysaccharides by Response Surface Methodlogy, the study investigated extracting temperature, time and liquid ratio on the polysaccharide extraction yield.〔Methods〕On the basis of the previous results and according to the principle of Box-Behnken experiment design, the results showed that the best extraction technology conditions were determined as follows: extraction time 1.68 h, extraction temperature 78.27 ℃, liquid ratio of 27.36∶1.〔Results〕Under optimum conditions, the extraction rate of polysaccharides up to 71.19%.〔Conclusion〕On this basis of extract, jujube polysaccharides solution using sevage method eliminating the protein, under the conditions of the ratio of sample & Sevage is 1∶1, and the ratio of chloroform & n-butanol is 4∶1, studied the extraction times effect of protein and polysaccharides, finding the best extracted six times.

polysaccharides etract; response surface methodlogy; eproteinized

1672-7606(2016)03-0167-05

2016-07-20

2016年度河南省高校科技創(chuàng)新團隊藥食兩用資源研究開發(fā)項目(16IRTSTHN019)；河南省科技廳基礎(chǔ)前沿計劃(142300410123，152300410064)；開封市創(chuàng)新人才項目(1509010)；河南大學民生學院教育教學改革研究項目(MSJG2015007，MSJG2015040)；河南大學2016年度大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(16NA058)

魏金鳳(1975-)，女，河南開封人，副教授，博士。從事藥用植物活性成分研究。

康文藝(1971-)，男，黑龍江尚志人，教授，博士后，河南大學藥學院副院長。從事天然產(chǎn)物化學、中藥活性成分研究。

R28

A