芍藥苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制

劉天易

山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)南250000

芍藥苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制

劉天易

山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)南250000

目的：探討芍藥苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法：選擇健康雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、芍藥苷組及尼莫地平組各20只，建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦梗死面積，TU N EL檢測(cè)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，免疫組化法檢測(cè)大鼠大腦皮層中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：假手術(shù)組大鼠未表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺失癥狀，模型組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦梗死面積高于假手術(shù)組，芍藥苷組及尼莫地平組均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；假手術(shù)組幾乎未見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，模型組TU N EL陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于假手術(shù)組，芍藥苷組及尼莫地平組細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)及陽(yáng)性率均低于模型組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)中Bcl-2及Bax的灰度值均高于模型組，芍藥苷組及尼莫地平組大鼠Bcl-2灰度值較模型組降低，而B(niǎo)ax灰度值較模型組明顯升高，2組Bcl-2/Bax灰度值較模型組下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：芍藥苷可通過(guò)抑制Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)來(lái)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)功能，減輕腦梗死。

腦缺血再灌注；細(xì)胞凋亡；芍藥苷

近年來(lái)，有研究表明［1-2］，腦缺血再灌注對(duì)梗死區(qū)腦組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞凋亡在其損傷病理過(guò)程中起重要作用，尤其是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。細(xì)胞凋亡是缺血半暗帶內(nèi)細(xì)胞死亡的主要途徑，可造成梗死灶的形成及擴(kuò)大。因此，減少缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡，成為治療缺血性腦血管病的主要治療方向。芍藥苷（Peonif1orin，PF）為單萜糖苷類化合物，是一種毛茛科植物芍藥根中的生物活性成分，具有清熱涼血、散瘀止痛的作用［3］。本研究主要探討芍藥苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響及其主要作用機(jī)制，為臨床缺血性腦血管疾病的治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物健康雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量250～300 g，平均（280.5±15.9）g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：ab120836。

1.2藥物、試劑與儀器芍藥苷粉劑（南京青澤藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：110736-201435）；尼莫地平注射液（上海信誼金珠藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20000682）；TUNEL試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：11684817910）；Bc1-2兔抗鼠多克隆抗體和Bax兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；TGL-16G型低溫冷凍離心機(jī)（日本日立公司生產(chǎn)）；722s分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠生產(chǎn)）。

1.3方法將80只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、芍藥苷組及尼莫地平組，每組20只。所有大鼠均于術(shù)前30分鐘腹腔注射藥物，芍藥苷組給予芍藥苷60 mg/kg；尼莫地平組給予尼莫地平0.4 mg/kg；假手術(shù)組及模型組大鼠均予等量生理鹽水。

1.4模型建立大鼠腦缺血再灌注模型建立使用改良Longa線栓法：首先使用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，將左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈鈍性分離后，對(duì)頸外動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎處理，用動(dòng)脈夾將頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端夾閉，并于頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端剪一切口，將頭端鈍化的直徑0.234 mm的魚(yú)線沿頸總和頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入，松開(kāi)動(dòng)脈夾，阻塞大腦中動(dòng)脈，固定栓線并縫合切口。將所有模型大鼠放回籠內(nèi)并給予食物和水，同時(shí)保持體溫在37℃左右，24小時(shí)后拔線，再灌注24小時(shí)。假手術(shù)組大鼠只進(jìn)行左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈的分離，不阻塞大腦中動(dòng)脈，其余步驟與模型大鼠相同。大鼠模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物清醒后，出現(xiàn)上眼瞼下垂、瞳孔散大，爬行時(shí)向右側(cè)傾斜或順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，提尾時(shí)大鼠右前肢內(nèi)收屈曲等表現(xiàn)，同時(shí)大鼠存活達(dá)24小時(shí)。

1.5神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分大鼠麻醉清醒后，依據(jù)Longa等方法對(duì)其神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評(píng)分。1）0分，正?；顒?dòng)，無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；2）1分，提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢部能完全伸直；3）2分，爬行時(shí)表現(xiàn)為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4）3分，行走時(shí)表現(xiàn)為身體向?qū)?cè)傾倒；5）4分，不能自主行走，意識(shí)喪失。得分越高，表明動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。

1.6指標(biāo)檢測(cè)TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡：大鼠再灌注24小時(shí)后，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，每組各取8只大鼠經(jīng)左心室灌流生理鹽水，沖出血液，并用4%多聚甲醛灌流固定，固定完成后立即斷頭取腦，將腦組織放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水并使用石蠟包埋，自視交叉前緣向后連續(xù)冠狀位切片，片厚4 μm，取相同層面石蠟切片4張，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞核表現(xiàn)為固縮、濃染的棕褐色顆粒，多見(jiàn)于梗死灶周圍的腦組織。Bc1-2和Bax蛋白表達(dá)：取上述石蠟切片，采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色即為陽(yáng)性細(xì)胞。采用CIAS-1000型圖像分析儀測(cè)量每組平均灰度值，平均灰度值越低，表明切片免疫組化染色越深，蛋白陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分假手術(shù)組大鼠未表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺失癥狀，模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于假手術(shù)組，芍藥苷組及尼莫地平組明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組腦梗死面積高于假手術(shù)組，芍藥苷組及尼莫地平組低于模型組，其但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況假手術(shù)組幾乎未見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，模型組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于假手術(shù)組，芍藥苷組及尼莫地平組細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)及陽(yáng)性率明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3大鼠大腦皮層Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)情況假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)中Bc1-2及Bax的灰度值均高于模型組，即蛋白的表達(dá)較低，芍藥苷組及尼莫地平組大鼠Bc1-2灰度值較模型組降低，而B(niǎo)ax灰度值較模型組升高，即Bc1-2蛋白的表達(dá)增加而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)降低，2組Bc1-2/Bax灰度值較模型組下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表1　大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（±s）

表1　大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（±s）

注：△表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05。

組別只數(shù)劑量/（m g·kg-1）神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分/分腦梗死面積/%假手術(shù)組20-00模型組20-3.1±0.5△0.5±0.1△芍藥苷組20602.5±0.4▲0.4±0.1尼莫地平組200.42.3±0.5▲0.4±0.1

表2　大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較（±s）

表2　大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較（±s）

注：△表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，▲P＜0.05。

組別只數(shù)劑量/（m g·kg-1）細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)/個(gè)陽(yáng)性率/%假手術(shù)組8-00模型組8-12.0±1.8△66.2±7.3△芍藥苷組8607.2±1.9▲42.0±8.4▲尼莫地平組80.47.7±1.9▲43.1±7.6▲

表3　大鼠大腦皮層Bcl-2及Bax的灰度值（±s）

表3　大鼠大腦皮層Bcl-2及Bax的灰度值（±s）

注：△表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05。

組別只數(shù)劑量/（m g·kg-1）Bcl-2/kD aBax/kD aBcl-2/Bax假手術(shù)組8-172.4±6.8173.0±7.30.9±0.1模型組8-161.4±5.2△140.0±5.2△1.2±0.1△芍藥苷組860123.1±5.5▲159.8±5.9▲0.8±0.1▲尼莫地平組80.4122.0±5.9▲161.2±6.2▲0.7±0.1▲

3　討論

有研究認(rèn)為［4］，腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生的主要原因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞凋亡，其主要通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，對(duì)Caspase家族、Bc1-2家族、P38MAPK、Fas/Fas1等基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，造成腦缺血損傷，尤其在缺血半暗帶區(qū)，細(xì)胞凋亡成為神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要方式［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠未表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺失癥狀，模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分高于假手術(shù)組，且模型組大鼠腦梗死面積明顯高于假手術(shù)組，另外，假手術(shù)組幾乎未見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，模型組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞多于假手術(shù)組，表明腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況明顯增多。

目前，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺血性腦血管病屬“中風(fēng)”范疇，其主要病機(jī)特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)［6］，有研究認(rèn)為［7］，腎虛為該病之本，風(fēng)痰瘀熱毒為該病之標(biāo)，病位在腦之脈絡(luò)，因此，中藥治療手段應(yīng)以補(bǔ)腎益氣活血為主，使腎精得復(fù)，腦髓得充，腦絡(luò)得養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)［8］芍藥苷具有抗自由基損傷，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載以及抗神經(jīng)毒性等活性，可明顯降低機(jī)體血液黏度，擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)等，改善腎功能。另外，近年國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用芍藥苷治療的大鼠，其神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分低于模型組，而且腦梗死面積小于模型組，同時(shí)其神經(jīng)細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)及陽(yáng)性率均較模型組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明芍藥苷所具有的補(bǔ)腎益氣功效在一定程度上可減少大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)功能。有研究報(bào)道［11］，Bc1-2家族主要包括抗凋亡基因（Bc1-2、Bc1-x1等）和促凋亡基因（Bad、Bax等）兩大類，其中Bc1-2和Bax是調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的兩個(gè)重要相關(guān)基因，在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中，Bc1-2過(guò)表達(dá)可有效抑制細(xì)胞凋亡，當(dāng)抑制Bc1-2基因表達(dá)或敲除時(shí)可加速缺血神經(jīng)細(xì)胞的死亡；而B(niǎo)ax過(guò)表達(dá)可抑制Bc1-2基因表達(dá)從而促使細(xì)胞凋亡，因此，Bc1-2/Bax比值同樣是決定細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，當(dāng)比值增大時(shí)，細(xì)胞凋亡受抑制，反之則促進(jìn)細(xì)胞凋亡，一般在正常大鼠腦組織中Bc1-2和Bax表達(dá)均較少，當(dāng)出現(xiàn)腦缺血再灌注時(shí)，兩種基因表達(dá)水平均明顯升高［12］。本研究中模型組大鼠Bc1-2和Bax蛋白的表達(dá)水平較假手術(shù)組升高，芍藥苷組及尼莫地平組大鼠Bc1-2灰度值較模型組降低，而B(niǎo)ax灰度值較模型組升高，即Bc1-2蛋白的表達(dá)增加而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)降低，2組Bc1-2/Bax灰度值較模型組下降，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示芍藥苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bc1-2和Bax蛋白的表達(dá)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦梗死。

［1］高維娟，張霞，劉莎莎.大鼠腦缺血再灌注后海馬CA 1區(qū)Caspase-3的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33（24）:6202-6204.

［2］屈惠瑩，袁靜，包翠芬，等.人參皂苷Rg1對(duì)腦缺血再灌注大鼠nN O S、i N O S表達(dá)的影響［J］.天津醫(yī)藥，2014，42（9）:889-893.

［3］韓江全，于奎營(yíng)，何敏，等.葛根素對(duì)大鼠腦缺血再灌注側(cè)皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡及p-A kt（Ser473）表達(dá)的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33（22）:5619-5621.

［4］肖晗，湯其強(qiáng)，劉磊磊，等.丹參酮IIA對(duì)大鼠腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡、D rp-1、TRPM 7表達(dá)的影響［J］.中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志，2013，39（12）:719-723.

［5］于奎營(yíng)，韓江全，張海霞.bFG F對(duì)大鼠腦缺血再灌注側(cè)皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡及p-A kt（Ser473）表達(dá)的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（23）:3035-3037.

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The Effects of Peoniflorin on Cellular Apoptosis of the Rats with Cerebral I shchemia R eperfusion Injury and Its Mechanism

LIU Tianyi
Pharmaceutical Department of Affiliated Hospital to Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250000，China

Objective:To investigate the effects of peoniflorin on cellular apoptosis of the rats with cerebral ischemia reperfusion injury and its mechanism.Methods:Eighty SD rats were randomized into sham operation group，the model group，peoniflorin group and nimodipine group，20 cases in each group，the rat model with cerebral ischemia reperfusion injury was established，neurological behavior score and infarct area of the rats in different groups were observed，neural cell apoptosis of the rats were detected by TUNEL，the expressions of Bcl-2 and Bax protein were measured by immunohistochemical method.Results:The rats in the sham operation group didn't manifest the symptoms of nerve function impairment，the model group was higher than the sham operation group in neurological behavior score and infarct area obviously，peoniflorin group and nimodipine group were lower than the model group notably，and the difference showed statistical meaning（P＜0.05）；no nerve cellular apoptosis had been seen in the sham operation group，the model group was more than the sham operation group in TUNEL positive cells，peoniflorin group and nimodipine group were lower than the model group in the numbers of apoptotic cells and positive rates significantly，and the difference showed statistical meaning（P＜0.05）；gray levels of Bcl-2 and Bax in the sham operation group were higher than these of the model group，gray level of Bcl-2 decreased in peoniflorin group and nimodipine group compared with the model group，while Bax gray level raised obviously in both groups compared with the model group，and the difference demonstrated statistical meaning（P＜0.05）.Conclusion:Peoniflorin could inhibit the apoptosis of nerve cells by inhibiting the expressions of Bax and up regulating Bcl-2 expressions，thereby to protect nerve function and alleviate cerebral infarction.

cerebral ischemia reperfusion；cellular apoptosis；peoniflorin

R285.5

A

1004-6852（2016）05-0008-04

2015-02-23

劉天易（1983—），男，碩士學(xué)位，主管藥師。研究方向：中藥學(xué)及中藥藥理學(xué)。