shRNA靶向抑制CD74基因?qū)θ四I透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O生物學(xué)行為的影響

紀(jì)世琪，孫志偉，韓志興，張海建， 程文龍， 趙玉千

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院泌尿外科，北京　100015；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京　100069)

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·基礎(chǔ)研究·

shRNA靶向抑制CD74基因?qū)θ四I透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O生物學(xué)行為的影響

紀(jì)世琪1，孫志偉2，韓志興1，張海建1， 程文龍1， 趙玉千1

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院泌尿外科，北京100015；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京100069)

目的探討抑制人CD74基因后對(duì)腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響。 方法通過慢病毒lentivirus-CD74轉(zhuǎn)染腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)786-O細(xì)胞活力的變化，利用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡變化情況，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)786-O細(xì)胞侵襲能力改變情況，采用Westernblot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后786-O細(xì)胞CD74及相關(guān)蛋白的變化情況。結(jié)果慢病毒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后細(xì)胞中CD74蛋白水平表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，抑制CD74蛋白表達(dá)水平后786-O細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞活力降低，凋亡增加，細(xì)胞侵襲能力降低，且Survivin、MMP-2、MM-9蛋白也隨之下降，其與對(duì)照組結(jié)果對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制CD74的表達(dá)可以抑制腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞的增值和侵襲能力，CD74基因可能作為癌基因在腎透明細(xì)胞癌中起作用。

腎癌；腎透明細(xì)胞癌；CD74；增值；侵襲

CD74蛋白開始研究是作為一種Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物(major histoeompatibility complex classⅡ, MHCⅡ)相關(guān)的Ⅱ型跨膜糖蛋白被發(fā)現(xiàn)的。CD74蛋白生理?xiàng)l件下主要表達(dá)于單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、胃腸道黏膜上皮細(xì)胞及活化B細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞 (antigenpresentingcell，APC)[1]。作為MHCⅡ類分子的蛋白伴侶，CD74蛋白于機(jī)體免疫過程的抗原遞呈反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)CD74還可作為MIF蛋白的高親和受體，CD74蛋白參與調(diào)控由MIF觸發(fā)的各種細(xì)胞信號(hào)通路，并對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間(特別是腫瘤細(xì)胞)的黏附、轉(zhuǎn)移過程均參與表達(dá)調(diào)控。最新有研究發(fā)現(xiàn)CD74蛋白除了能參與機(jī)體免疫反應(yīng)外，在許多腫瘤中均有表達(dá)上調(diào)，如肝細(xì)胞癌、前列腺癌、宮頸癌、肺小細(xì)胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD74蛋白在這些腫瘤的發(fā)生、腫瘤組織周圍血管生成、腫瘤組織的發(fā)展和增加腫瘤侵襲能力及轉(zhuǎn)移能力等眾多方面均有重要的作用[2-5]。

腎細(xì)胞癌(renal cellcarcinoma, RCC)是泌尿外科最為常見的腫瘤之一，而腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)則占腎癌發(fā)病的絕大部分[6]，CD74在ccRCC中的表達(dá)及作用情況還罕有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討利用慢病毒轉(zhuǎn)染沉默CD74基因?qū)δI透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響，尋找CD74影響腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)的可能途徑。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)挑選腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞系培養(yǎng)，細(xì)胞購自北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科研究所。腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞液氮中取出復(fù)蘇，在5% CO237℃環(huán)境中，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組：786-O細(xì)胞組(正常腫瘤細(xì)胞培養(yǎng))、對(duì)照細(xì)胞組(加入慢病毒陰性液培養(yǎng)細(xì)胞)、CD74轉(zhuǎn)染抑制細(xì)胞組(加入重組慢病毒培養(yǎng)細(xì)胞)。

1.2試劑上海吉?jiǎng)P基因公司提供CD74的shRNA重組慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒，CD74 shRNA靶序列：ACACAGCTACAGCTTTCTT。小鼠抗人CD74多克隆抗體購自Sigma公司(美國)，兔抗人Survivn、MM-2、MM-9多克隆抗體均購自CST公司(美國)，兔抗人β-Actin抗體、堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體、AP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體均購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司(北京)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)ccRCC 786-O細(xì)胞培養(yǎng)至5萬～8萬個(gè)，去血清同步化培養(yǎng)6 h，以1 μL∶10 000細(xì)胞數(shù)的比例，將病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)8 h，更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，熒光電子顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞效率。

1.4細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)(MTT實(shí)驗(yàn))將786-O細(xì)胞組、對(duì)照細(xì)胞組和CD74轉(zhuǎn)染抑制細(xì)胞組于0、12、24、48、72、96 h行MTT檢測(cè)，細(xì)胞活力檢測(cè)按照試劑盒中說明(南京凱基公司)進(jìn)行操作。應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，測(cè)定各孔的不同時(shí)間光吸收值。

1.5流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)將病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)染成功的786-O細(xì)胞，行流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)，以胰酶消化液(不含EDTA)消化待檢測(cè)細(xì)胞，用PBS沖洗液將待檢測(cè)細(xì)胞懸液清洗兩次，細(xì)胞懸液中加入500 μL Binding Buffer，搖勻后5 μL Annexin V-FITC加入懸液，混勻，懸液中再加入5 μL Propidium Iodide，懸液混勻，室溫、避光環(huán)境下靜置反應(yīng)10 min，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.6Tanswell小室實(shí)驗(yàn)50 mg/L Matrigel與稀釋液按1∶5稀釋，于上室聚碳酸酯膜上表面加入30 μL已稀釋后的Matrigel (3.9 μg/μL)，靜置于37 ℃環(huán)境中30 min，使Matrigel聚合形成凝膠。100 μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基加入每孔，于37 ℃靜置30 min。消化3組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，離心棄去含10%胎牛血清培養(yǎng)液，用PBS沖洗液清洗、離心 2次，加入無血清的培養(yǎng)基，配置成新的細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5×105/mL，3組懸液各取100 μL加入Transwell小室，于下室加入10%血清的1640培養(yǎng)基500 μL，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)48 h，擦去上室內(nèi)的細(xì)胞及上層的基質(zhì)膠，取下聚碳酸酯膜以4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行聚碳酸酯膜細(xì)胞染色。Leica DC 300F正置顯微鏡下觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照。

1.7Westernblot實(shí)驗(yàn)分別提取各組細(xì)胞蛋白，約60 μg，加入含β-巰基乙醇上樣緩沖液，沸水浴5 min，于配置好的10% SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠)上樣，蛋白電泳分離。電泳完成后，將蛋白恒壓電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，以5%脫脂奶粉封閉30 min，加入CD74蛋白抗體、Survivn、MM-2、MM-9多克隆抗體(1∶1 000)，搖床過夜4 ℃，PBS沖洗液洗膜3次，加入AP標(biāo)記的山羊抗小鼠/兔IgG二抗，孵育雜交，30 min室溫?fù)u床，取下纖維素膜滴加顯色液，發(fā)光顯色，以β-Actin的吸光度值為參照，掃描并分析各條帶的吸光度值。

2　結(jié)　果

2.1病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光顯微鏡鏡下觀察，被病毒轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，顯示病毒轉(zhuǎn)染效率較高，證明利用慢病毒技術(shù)可以成功高效轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞(圖1)。

圖1　慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果

慢病毒轉(zhuǎn)染具有高效性，72 h成功轉(zhuǎn)染的786-O細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光。

2.2細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)病毒轉(zhuǎn)染抑制CD74蛋白表達(dá)后，786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖活性明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡數(shù)增加。轉(zhuǎn)染細(xì)胞組在轉(zhuǎn)染72 h抑制效率達(dá)最大 (47±4)%，較對(duì)照組細(xì)胞(100%)和786-O細(xì)胞組(100%)的增殖活力降低(53±2)%(P<0.01，圖2)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染組72 h，凋亡細(xì)胞數(shù)(29±4)%最多，786-O組為(3.5±1)%，對(duì)照組細(xì)胞為(4.2±2)%(P<0.05)。

圖2　細(xì)胞活力MTT檢測(cè)結(jié)果

2.3Transwell小室實(shí)驗(yàn)(侵襲實(shí)驗(yàn))小室薄膜細(xì)胞染色結(jié)果顯示，在慢病毒抑制CD74蛋白表達(dá)后，腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)減少，腫瘤細(xì)胞侵襲能力明顯下降(圖3)，48 h細(xì)胞培養(yǎng)后，786-O組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為121.4±2.1，對(duì)照組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為116.8±3.2，轉(zhuǎn)染組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)為60.9±3.3(P<0.05)。

圖3　小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

在光鏡下觀察結(jié)晶紫染色后786-O組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染組抑制CD74表達(dá)后細(xì)胞侵襲能力降低，細(xì)胞數(shù)明顯減少。

2.4Westernblot蛋白檢測(cè)各組中均有CD74蛋白的表達(dá)，對(duì)照組中CD74蛋白表達(dá)明顯，而細(xì)胞轉(zhuǎn)染組中CD74蛋白表達(dá)均明顯受抑，隨CD74蛋白抑制后Survivin、MMP-2、MM-9蛋白也隨之下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4Westernblot蛋白印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果

條帶分別顯示CD74、Survivin、MMP-2、MMP-9和β-Actin蛋白的表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染組抑制CD74表達(dá)后，Survivin、MMP-2、MMP-9也隨之減。

3　 討　論

RCC作為泌尿外科最為常見的腫瘤，腫瘤起源于腎小管上皮細(xì)胞，其中ccRCC是腎細(xì)胞癌最常見的發(fā)病類型，對(duì)早期腎細(xì)胞癌患者行之有效的手段為腎癌根治術(shù)和腎部分切除術(shù)，已得到泌尿外科醫(yī)師的廣泛認(rèn)可，蘇拉菲尼和蘇尼替尼等靶向藥物的治療也在臨床上取得了一定的成效，但對(duì)于晚期腎細(xì)胞癌患者，特別是存在腫瘤轉(zhuǎn)移的患者，生存率依然較低，當(dāng)前也缺乏行之有效的治療手段[6-7]。隨著近年來，流行病學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因診斷學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，參與腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的因素被大量發(fā)現(xiàn)，泌尿外科已將腎細(xì)胞癌分子生物學(xué)作為熱點(diǎn)領(lǐng)域進(jìn)行研究[7]。

最近的大量研究顯示，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中炎癥因子扮演著重要的角色，許多腫瘤的發(fā)生都來源于慢性炎癥的持續(xù)性刺激，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞在機(jī)體的存活、增殖和轉(zhuǎn)移。CD74蛋白作為與Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物(major histoeompatibility complex classⅡ, MHCⅡ)相關(guān)的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白。CD74蛋白一般主要表達(dá)于APC細(xì)胞，近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，CD74蛋白高表達(dá)于許多惡性腫瘤組織，CD74蛋白所具有的其他生物學(xué)作用正逐漸被研究認(rèn)識(shí)[1,3]。機(jī)體內(nèi)源性抗原多種多樣，腫瘤細(xì)胞抗原亦可作為潛在的內(nèi)源性抗原分子，CD74蛋白具有能夠阻斷MHC-II類分子與內(nèi)源性免疫抗原肽結(jié)合的能力，所以當(dāng)CD74蛋白大量表達(dá)以后，可以降低腫瘤細(xì)胞的免疫源性，從而大大增加了腫瘤細(xì)胞逃離免疫監(jiān)視的機(jī)會(huì)，使腫瘤細(xì)胞得以存活下來。除此以外，MIF基因?qū)53基因有負(fù)性調(diào)控，當(dāng)MIF與CD74結(jié)合后，可以降低p53的磷酸化水平，減少細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期繼續(xù)進(jìn)行[4]。還有研究表明，在非小細(xì)胞肺癌組織中CD74與MIF存在共表達(dá)的情況，MIF/CD74復(fù)合物可以增加CXC趨化因子等促進(jìn)血管新生的因子分泌，增加腫瘤及周圍組織的血管密度，由此推測(cè)CD74蛋白可能還可以參與調(diào)控血管生成相關(guān)的因子，來影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[1-2]。

本研究發(fā)現(xiàn)CD74在腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞中表達(dá)，通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，抑制了CD74蛋白在腎透明癌細(xì)胞786-O中的表達(dá)，786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力受到了明顯抑制，786-O細(xì)胞凋亡增加，并呈現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性，72h達(dá)到高峰。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制CD74表達(dá)后腫瘤細(xì)胞穿過基底膜數(shù)量減少，細(xì)胞侵襲能力降低，隨CD74蛋白被抑制后Survivin、MMP-2、MM-9蛋白表達(dá)也隨之出現(xiàn)下降。細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡信號(hào)失控是惡性腫瘤發(fā)生的重要標(biāo)志，Survivin(存活素、生存素)屬于凋亡抑制蛋白家族(IAP)的成員，于大多數(shù)正常終末分化組織中無表達(dá)或較少表達(dá)，而在許多機(jī)體腫瘤組織中均有大量表達(dá)；Survivin不僅具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)在細(xì)胞的有絲分裂環(huán)節(jié)、細(xì)胞的周期調(diào)控環(huán)節(jié)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞及周圍組織血管的生成環(huán)節(jié)中均起到重要作用[8]。既往大量研究顯示：RCC的分化、腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移與腎細(xì)胞癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的能力息息相關(guān), MMP-2和MMP-9在MMPs家族中屬于Ⅳ型膠原酶，作為最為重要的兩種水解蛋白，參與降解Ⅳ型膠原，而Ⅳ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)(extraeeUular matrix，ECM)和基底膜(basement membrane，BM)的主要成分，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用[9]。以上提示我們CD74可能作為癌基因，通過調(diào)控這些凋亡及侵襲的信號(hào)通路，對(duì)腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力產(chǎn)生作用[10]，但其影響腫瘤細(xì)胞的確切信號(hào)通路依然有待研究。

腎細(xì)胞癌發(fā)生的病因及影響因素至今還無法確定，我們通過本次研究CD74基因在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞786-O中的表達(dá)及相關(guān)作用，提示我們CD74對(duì)于腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義，可以進(jìn)一步深入研究，為揭示腎細(xì)胞癌的發(fā)生提供新的研究思路。

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(編輯何宏靈)

Inhibition of CD74 gene by shRNA affects the biological behaviors of human clear cell renal cell carcinoma cell line 786-O

JI Shi-qi1, SUN Zhi-wei2, HAN Zhi-xing1, ZHANG Hai-jian1, CHENG Wen-long1, ZHAO Yu-qian1

(1.Department of Urology, Beijing Ditan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100015;2.Public Health Institute, Capital Medical University,Beijing 100069, China)

ObjectiveTo explore the effect and mechanism of CD74 modulating growth and invasion on human clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) cell line 786-O. MethodsThe 786-O cells were transfected with lentivirus-CD74. The vitality of 786-O cells was detected with MTT assay. The apoptosis was detected with flow cytometry. The invasion was assessed with Transwell assay. The expression of CD74 was tested with Western blotting.ResultsAfter transfection, the expression of CD74 was decreased (P<0.05), the cell growth was significantly inhibited, apoptosis increased, invasion ability decreased, and the expression of Survivin, MMP-2 and MM-9 decreased (allP<0.05). ConclusionsKnocking down of CD74 induced decreased cell proliferation and invasion, which may play a role in the oncogenes of ccRCC.

renal cancer; clear cell renal cell carcinoma; CD74; proliferation; invasion

2016-02-01

2016-06-03

2013年首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床科研合作課題(No.1300171706)

趙玉千，主任醫(yī)師.E-mail：zhaoyuqian56@sina.com

紀(jì)世琪(1983-), 男(滿族), 博士研究生, 副主任醫(yī)師.研究方向:泌尿系腫瘤. E-mail: jishiqi09 @163. com

R737

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.09.017