IGF-1R抑制劑NVP-AEW541在腎上腺皮質(zhì)癌SW13細(xì)胞系中的作用

林登強(qiáng)，徐烈雨，廉建坡，王曉晶，何竑超，王衛(wèi)慶，寧　光，?！∮?/p>

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院：1.泌尿外科；2.內(nèi)分泌科，上?！?00025)

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·基礎(chǔ)研究·

IGF-1R抑制劑NVP-AEW541在腎上腺皮質(zhì)癌SW13細(xì)胞系中的作用

林登強(qiáng)1，徐烈雨1，廉建坡1，王曉晶1，何竑超1，王衛(wèi)慶2，寧光2，祝宇1

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院：1.泌尿外科；2.內(nèi)分泌科，上海200025)

目的通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探尋IGF-1R抑制劑NVP-AEW541阻斷IGFR信號通路的激活，評價其對SW13細(xì)胞增殖、凋亡的影響情況。 方法通過MTT試驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的改變，通過Western blot檢測IGFR下游信號通路成員ERK和mTOR的表達(dá)情況。 結(jié)果NVP-AEW541可以呈濃度-時間依賴性抑制細(xì)胞增殖、呈濃度依賴性促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡和晚期壞死，并下調(diào)p-AKT的表達(dá)水平，而不影響mTOR的磷酸化水平和RAS/RAF/ERK信號傳導(dǎo)通路。結(jié)論IGF-1R抑制劑NVP-AEW541可以通過下調(diào)AKT的磷酸化水平，從而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有潛在的抗腫瘤作用。

SW13;NVP-AEW541;胰島素樣生長因子;PI3K信號通路

腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma，ACC)是起源于腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤，臨床罕見，發(fā)病率約為0.7～2.0/106人[1]。該病惡性程度高、侵襲性強(qiáng)，但由于缺乏特異性診斷指標(biāo)，常常造成早期診治困難。目前針對早期ACC，手術(shù)切除是最有效的方法，尤以根治性手術(shù)為主，但因缺乏有效的輔助治療，導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)率高、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差，平均生存期僅有18個月[2]。而晚期或全身復(fù)發(fā)的患者，以藥物治療為主，尤其是米托坦，但總體療效欠佳。因此，尋求一種有效的治療方式，始終是研究人員密切關(guān)注的焦點(diǎn)。

近來研究表明，腫瘤細(xì)胞能夠通過自分泌或者旁分泌途徑大量表達(dá)胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factors-1，IGF-1)[3]，并通過活化胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factors-1 receptor,IGF-1R)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4]。同時，在結(jié)直腸癌、乳腺癌和黑色素瘤中均發(fā)現(xiàn)IGF-1R過表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[5-7]。值得注意的是，胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGFs)在正常腎上腺的形成、發(fā)育中同樣發(fā)揮重要的作用[8]。并且ACC細(xì)胞也能通過自分泌或旁分泌途徑過表達(dá)IGF-2和IGF-1R[9]。而IGF-1R抑制劑被認(rèn)為是腎上腺皮質(zhì)癌最有效的靶向治療藥物[10]。因此，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)探討運(yùn)用IGFR選擇性抑制劑NVP-AEW541阻斷IGFs的作用效果，評價對ACC細(xì)胞增殖、凋亡、下游信號通路和細(xì)胞周期的影響程度，旨在為臨床提供新的可能治療方案。

1　材料與方法

1.1材料SW-13細(xì)胞株(中科院上海生化細(xì)胞所)、IGF-1R抑制劑NVP-AEW541(美國selleck公司)，兔抗人ERK、mTOR、p-ERK和p-mTOR單克隆抗體(美國CST公司)、含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%雙抗的改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle mediumDMEM)(美國Gibco公司)、MTT和DMSO(美國Sigma公司)、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(美國BD公司)；培養(yǎng)箱(德國Heraus公司)、OLYMPUS BX50型雙目顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、電泳儀(上海Tanon公司)、流式細(xì)胞儀(美國Beckton Dickson公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)含10%(體積分?jǐn)?shù))的胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、90%濕度的恒溫孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每3 d傳代1次。

1.2.2MTT實(shí)驗(yàn)將對數(shù)生長期的SW13細(xì)胞接種于96孔板(6.0×103/孔)，完全貼壁后加入藥物，濃度分別是0.1、1.0、5.0、10.0 μmol/L，周圍30孔加入PBS溶液200 μL/孔預(yù)防邊緣效應(yīng)，孵箱培養(yǎng)24、48、72 h后行MTT測定細(xì)胞活性。加入10%MTT(200 μL/孔)，避光培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO(100 μL/孔)，搖床震蕩10 min，于酶標(biāo)儀450 nm波長條件下檢測各組吸光度，處理數(shù)據(jù)、繪制曲線。每組5個復(fù)孔，設(shè)置空白對照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Annexin-V/PI雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板(3.5×105/孔)，并加入藥物，濃度分別是2.0、5.0 μmol/L，孵箱培養(yǎng)24 h后，加入0.025%胰酶200 μL/孔消化30 s左右，加入1 mL培養(yǎng)液終止消化，離心處理5 min(14 000 r/min)，棄去上清，加入binding buffer(60 μL/管)重懸細(xì)胞和Annexin-V(5 μL)，避光10 min；上機(jī)前5 min，加入PI，補(bǔ)充binding buffer(100 μL/管)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。每組3個復(fù)孔，設(shè)置空白對照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot細(xì)胞收獲前0.5 h向6孔板內(nèi)加入50 μg/L濃度的IGF-1。隨后配制裂解液(RIPA、cocktail 、PMSF體積比100∶10∶1)，處理對應(yīng)的細(xì)胞，4 ℃冰箱裂解30 min，刮取干凈后放入離心機(jī)(4 ℃、13 000 r/min，30 min)離心處理，取上清液，并加入loading buffer，溫育10 min，-20℃保存待用。SDS聚丙酰胺凝膠電泳分離相應(yīng)蛋白，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，5%BSA封閉處理1 h，加入一抗，搖床處理20 min，4 ℃過夜，PBST溶液洗滌4次(5 min/次)，加入二抗(3%BSA稀釋1∶10 000)，相同方法洗滌4次后機(jī)器顯影。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1NVP-AEW541呈濃度-時間依賴性抑制SW13細(xì)胞增殖通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NVP-AEW541可以抑制SW13細(xì)胞增殖，并呈濃度-時間依賴性關(guān)系(圖1)。其中，各組結(jié)果與空白對照組結(jié)果均存在差異，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。處理72 h，NVP-AEW541的IC50濃度為1.06 μmol/L。當(dāng)濃度增加到10.0 μmol/L,幾乎完全抑制SW13細(xì)胞的增殖行為。

圖1　MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2NVP-AEW541呈濃度依賴性誘導(dǎo)SW13細(xì)胞凋亡通過Annexin-V/PI雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，NVP-AEW541可以誘導(dǎo)SW13細(xì)胞的凋亡，并呈濃度依賴性(圖2)。其中，空白組、2 μmol/L實(shí)驗(yàn)組和5 μmol/L實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡率(Annexin-V+/PI-)和晚期凋亡率或壞死率分別是(3.14±0.41)%、(4.20±0.28)%、(6.07±0.32)%和(0.97±0.60)%、(1.67±0.65)%、(2.96±0.90)%。與空白組相比，兩組早期凋亡率分別是其1.34倍、1.93倍，而晚期則分別是其1.72倍、3.04倍。因此， NVP-AEW541呈濃度依賴性誘導(dǎo)SW13細(xì)胞早期凋亡和晚期壞死，尤其是早期細(xì)胞凋亡更為顯著。

2.3NVP-AEW541對IGFR下游信號通路的影響RAS/RAF/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路是IGFs下游最主要的兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因此我們通過Western blot半定量檢測下游信號通路成員的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)相比空白組，加入IGF-1的對照組中，p-AKT水平明顯升高；而加入NVP-AEW541后，實(shí)驗(yàn)組AKT磷酸化水平顯著降低，幾乎完全受抑制；而(p-)MEK、(p-)ERK并無明顯改變(圖3)。結(jié)果提示，NVP-AEW541可以通過下調(diào)AKT的磷酸化水平而影響PI3K信號通路，從而抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖2AnnexinV/PI雙標(biāo)記法檢測凋亡結(jié)果

AnnexinV(+)/PI(-)和AnnexinV(+)/PI(+)分別代表早期凋亡和晚期凋亡或壞死。

治療組和對照組間的比較，*P<0.05。

圖3Western blot結(jié)果

3　討　論

腎上腺皮質(zhì)癌是臨床罕見而惡性程度高的腫瘤。根治性手術(shù)切除是唯一可以治愈ACC的途徑，然而術(shù)后的復(fù)發(fā)率卻高達(dá)60%[11]，并且復(fù)發(fā)后，腫瘤的侵襲性增強(qiáng)，更易于發(fā)生轉(zhuǎn)移。而對于無法進(jìn)行手術(shù)的患者，米托坦是最常用、反應(yīng)率最高的藥物[12]。但WOOTEN等[13]對551例使用米托坦的患者進(jìn)行隨訪跟蹤1～205個月，發(fā)現(xiàn)米托坦的總體反應(yīng)率僅為35%。由于ACC細(xì)胞具有多重耐藥性，長期使用米托坦將導(dǎo)致藥效減弱，目前臨床建議米托坦與細(xì)胞毒性藥物聯(lián)用的化療方案，常用的是EDP-M(依托泊苷、多柔比星、順鉑、米托坦)和Sz-M(鏈脲霉素、米托坦)兩種方案。然而，兩者的治療效果同樣不盡如人意，患者的總體生存期僅有14.8個月。因此，尋找療效佳、耐受性好的藥物，特別是靶向治療藥物，已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。

研究顯示，IGFs信號網(wǎng)絡(luò)在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。而在腎上腺皮質(zhì)功能發(fā)展和維持過程中，IGFs系統(tǒng)同樣具有重要價值。大約90%的ACC存在IGF-2過表達(dá)現(xiàn)象[14]，而其過表達(dá)被認(rèn)為是ACC分子水平中最具有特征性的改變[15]。IGF-2主要通過IGF-1R介導(dǎo)，激活下游的RAS/RAF/ERK、PI3K/AKT/mTOR和JAK/STAT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡[16]。

因此，本研究將高效的IGF-1R抑制劑——NVP-AEW541應(yīng)用于SW13細(xì)胞系， 通過MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NVP-AEW541能以濃度-時間依賴性顯著抑制SW13細(xì)胞的增殖，當(dāng)作用72 h時，NVP-AEW541對細(xì)胞增殖的IC50為1.06 μmol/L；當(dāng)濃度增加到10.0 μmol/L,幾乎完全抑制SW13細(xì)胞的增殖行為。

我們進(jìn)一步通過流式細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，NVP-AEW541同樣可以呈濃度相關(guān)性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與空白組相比，2 μmol/L和5 μmol/L兩個NVP-AEW541處理組早期凋亡率分別是其1.34倍、1.93倍，而晚期分別是其1.72倍、3.04倍。比較每組的早、晚期細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)NVP-AEW541對細(xì)胞早期凋亡的影響更為顯著。

IGF1作用于IGF-1R胞外α亞基，促發(fā)構(gòu)象改變，導(dǎo)致胞內(nèi)β亞基自身酪氨酸磷酸化，隨即通過RAS/RAF/ERK、PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。因此，我們通過Western blot檢測ERK、mTOR等蛋白的表達(dá)情況，探尋NVP-AEW541在抑制SW13增殖、誘導(dǎo)凋亡中的分子作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，p-AKT的表達(dá)水平呈NVP-AEW541濃度依賴性降低，而RAS/RAF/ERK通路并無明顯改變。提示NVP-AEW541抑制IGF-1R活性，進(jìn)一步阻斷AKT的磷酸化，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。有意思的是，本研究并未發(fā)現(xiàn)AKT下游靶點(diǎn)mTOR的磷酸化水平降低。分析可能的原因是：①NVP-AEW541可以激活mTOR代償性激活通路，從而保證mTOR水平不受影響；②AKT下游靶點(diǎn)眾多，包括NF-κB、MDM2等，而NVP-AEW541抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用并不依賴于mTOR的活化。先前已有研究表明在人腎上腺皮質(zhì)癌H295R細(xì)胞系中，IGFs能夠激活腫瘤的“逃逸機(jī)制”,免遭mTOR抑制劑的作用[17]。而結(jié)合我們的研究，提示IGF-1R和mTOR抑制劑或許具有協(xié)同治療ACC的作用。

綜上所述，本研究從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF-1R抑制劑NVP-AEW541可以通過下調(diào)AKT的磷酸化水平，呈濃度依賴性促進(jìn)SW13細(xì)胞系凋亡(尤其是早期細(xì)胞凋亡)、抑制細(xì)胞增殖，具有潛在的抗腫瘤作用。并且對深入探尋針對ACC的靶向治療藥物具有一定的參考價值，包括后期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究。ACC的發(fā)生可能與多條信號通路的激活有關(guān)，提示未來的研究方向，可以重點(diǎn)考察多靶點(diǎn)聯(lián)合抑制劑(尤其是mTOR抑制劑)對于ACC的治療效果或者運(yùn)用更為高效的IGF-1R抑制劑。

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(編輯王瑋)

The effect of IGF-1R inhibitor NVP-AEW541 on adrenocortical carcinoma SW13 cell line

LIN Deng-qiang1,XU Lie-yu1,LIAN Jian-po1,WANG Xiao-jing1,HE Hong-chao1, WANG Wei-qing2, NING Guang2, ZHU Yu1

(1.Department of Urology，2.Department of Endocrinology, Ruijin Hospital Affiliated to Medical School of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)

ObjectiveTo explore the effect of NVP-AEW541 on adrenocortical carcinoma(ACC) cell line SW13 in vitro.MethodsAfter SW13 cells were treated with NVP-AEW541,the proliferation and apoptosis were detected with MTT assay and flow cytometryrespectively. The expressions of ERK and mTOR were detected with Western blotting. ResultsNVP-AEW541inhibitedtheproliferationin a dose- and time-dependent manner, promotedtheapoptosis in a dose-dependent manner, down-regulatedthelevel of p-AKT protein expression, but did not affect the expression of p-mTOR protein and RAS/RAF/ERK signaling pathway. ConclusionsNVP-AEW541 is effective to inhibit SW13 proliferation and promote SW13 apoptosis by reducing the expression level of p-AKT. It has anti-tumor potential.

SW13; NVP-AEW541; insulin-like growth factor; PI3K signaling pathway

2016-05-24

2016-07-18

國家自然科學(xué)基金(No.81272936)，上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)項(xiàng)目基金(No.134119a2700)

祝宇，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師.E-mail：zyyyhyq@126.com

林登強(qiáng)(1991-)，男(漢族)，學(xué)士學(xué)位，在讀碩士研究生.研究方向：泌尿系腫瘤.E-mail：ldq888@foxmail.com

R736.6

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.09.016