HPLC法測(cè)定三華李花色苷的成分及含量

黃月，黃葦，李媛

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

HPLC法測(cè)定三華李花色苷的成分及含量

黃月，黃葦*，李媛

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642）

三華李果實(shí)富含紅色素，對(duì)其紅色素的主要成分進(jìn)行了定性和定量測(cè)定，明確其結(jié)構(gòu)和含量，為三華李的加工利用提供參考。采用WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A：乙腈，B：4%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0min～25min，6%A～16%A。檢測(cè)波長(zhǎng)520nm，柱溫箱40℃，流速1mL/min。試驗(yàn)結(jié)果表明三華李果實(shí)中紅色素主要為矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷，矢車菊素-3-半乳糖苷未檢出。外標(biāo)法定量，前二者的含量分別為87.26mg/kg和32.41 mg/kg。兩種花色苷在0.000 5 mg/mL～0.100 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定回歸系數(shù)R2分別為0.9999和0.9998。兩種花色苷的加標(biāo)回收率均大于95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.93%和2.40%。樣品重復(fù)性好，進(jìn)樣峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于等于1.23%。本方法簡(jiǎn)便可行，結(jié)果可靠，適用于三華李花色苷成分和含量的測(cè)定。

三華李；花色苷；高效液相色譜

三華李為薔薇科李屬植物，最早因在廣東省韶關(guān)市翁源縣三華鄉(xiāng)種植而得名［1］。三華李紅皮紅肉，酸甜適宜，是鮮食和加工的良好材料。呈現(xiàn)紅色、紫紅或者紫黑的水果多含有花色苷，花色苷是由花色素和糖以糖苷鍵形式結(jié)合的化合物，屬于黃酮類化合物，具有典型的C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，是廣泛分布于自然界的水溶性天然食用色素［2］。花色素主要有矢車菊色素、天竺葵色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ氐攘箢悾煌幕ㄉ睾筒煌奶墙Y(jié)合，形成了不同花色苷的顏色差異?；ㄉ兆鳛橐环N天然色素，安全、無(wú)毒，具有很好的著色力，并且具有多種功效，如抗氧化、抗變異、抗腫瘤、預(yù)防糖尿病、保護(hù)視力、抗動(dòng)脈粥樣硬化、防治心血管疾病和抑制血小板凝集等［3-7］。近年來(lái)，針對(duì)紅樹(shù)莓、桑葚、藍(lán)莓、血橙等果實(shí)的花色苷研究較多。李果實(shí)呈紅色的主要物質(zhì)也是花色苷類色素［8］，已有研究顯示，中國(guó)李、歐洲李、櫻桃李等多種李中的花色苷，主要為矢車菊花色苷和少量天竺葵花色苷，矢車菊花色苷又以矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷等為主［8-10］。目前有關(guān)廣東三華李紅色素開(kāi)展的研究，多針對(duì)其提取方法和抗氧化作用，均是通過(guò)最大吸收波長(zhǎng)來(lái)初步確定紅色素為黃酮類花色苷化合物［1，3］，鮮見(jiàn)對(duì)三華李花色苷結(jié)構(gòu)和含量進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析。

花色苷在可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)是520 nm［11］。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)三華李花色苷進(jìn)行測(cè)定，明確其主要花色苷的結(jié)構(gòu)和含量，為開(kāi)發(fā)和綜合利用廣東省特色水果三華李提供一定的參考。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1原材料

三華李：采自廣州市從化區(qū)龍豐園果子食品廠呂田水果生產(chǎn)示范基地。

1.1.2試劑與耗材

色譜純矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanin-3-glucoside）、矢車菊素-3-蕓香糖苷（cyanin-3-rutinoside）和矢車菊素-3-半乳糖昔（cyanin-3-galacoside）：德國(guó)sigma公司。色譜純甲醇、乙腈：hollywell公司；色譜純甲酸、分析純鹽酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。C18 Sep-Pak小柱：美國(guó)Waters公司。

1.1.3儀器

LC-15C高效液相色譜儀：日本島津公司；SHZ-3循環(huán)水真空泵：上海錦華層析設(shè)備廠；ALC-210.2電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HS-6150超聲波清洗器：北京恒奧德儀器儀表有限公司。

1.2方法

1.2.1色譜條件

島津C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A：乙腈，B：4%甲酸溶液，梯度洗脫程序：0 min～25 min，6%A～16%A。檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm，柱溫箱40℃，進(jìn)樣量為20 μL，流速1 mL/min。外標(biāo)法定量。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取花色苷標(biāo)準(zhǔn)品1mg，甲醇溶解定容于5mL棕色容量瓶中，搖勻作為儲(chǔ)備母液，低溫避光保存。

1.2.3樣品的制備

花色苷在偏酸性的條件下才能保持其2-苯基-苯并吡喃陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)。提取方法參照Wang Yan等［10］的方法并加以改進(jìn)，稱取果肉5 g，經(jīng)研磨后加入20 mL的0.1%鹽酸甲醇，4℃放置于冰箱靜置提取20 h，然后超聲波提取20 min，過(guò)濾去渣，用浸提液沖洗濾渣。合并提取液，37℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，4%甲酸水溶液回溶殘余物。

提取物用6 mL/500 mg C18 Sep-Pak小柱進(jìn)行純化。小柱活化：18mL甲醇，流速3 mL/min～5 mL/min；沖洗：20mL 0.1%的鹽酸水溶液，流速3mL/min～5mL/min；樣品上柱；沖洗：20 mL 0.1%的鹽酸水溶液，流速1 mL/min～2 mL/min；洗脫：20 mL 0.1%的鹽酸甲醇溶液。將純化后的花色苷樣品37℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，4%的甲酸水回溶殘余物，定容至10 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜，低溫保存。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

將標(biāo)準(zhǔn)品母液，用4%甲酸水稀釋成0.000 5、0.002 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100 0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.2.1的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，濃度（x）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2～圖4。

圖1　花色苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1Anthocyanins standard liquid chromatogram

圖2　矢車菊素-3-半乳糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2The standard curve of cyanin-3-galacoside

圖3　矢車菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3The standard curve of cyanin-3-glucoside

2.2精密度試驗(yàn)

圖4　矢車菊素-3-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4The standard curve of cyanin-3-rutinoside

將同一份0.020 0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣6次，按照1.2.1色譜條件測(cè)定，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。如表1所示，矢車菊素-3-半乳糖苷（A）、矢車菊素-3-葡萄糖苷（B）和矢車菊素-3-蕓香糖苷（C）的RSD分別為1.02%、1.07%、0.93%，表明在該色譜條件下精密度良好。

2.3樣品花色苷的測(cè)定

按照1.2.3方法提取和純化三華李花色苷后，經(jīng)色譜柱分離得到的色譜圖如圖5所示。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1Results of precision test

圖5　三華李花色苷色譜圖Fig.5Chromatography of anthocyanin in Sanhua plum

將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間相對(duì)照，樣品色譜圖中的色譜峰鑒定依次為矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷，分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6［11］。經(jīng)計(jì)算，三華李果實(shí)中矢車菊素-3-葡萄糖苷的含量為87.26 mg/kg，矢車菊素-3-蕓香糖苷的含量為32.41 mg/kg，矢車菊素-3-半乳糖苷未檢出。

圖6　矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷的分子結(jié)構(gòu)Fig.6The molecular structure of cyanin-3-glucoside and cyanin-3-rutinoside

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批三華李樣品5份，各5 g，按照1.2.3提取和純化樣品。經(jīng)測(cè)定，矢車菊素-3-葡萄糖苷（B）和矢車菊素-3-蕓香糖苷（C）峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.23%和0.98%，見(jiàn)表2。表明樣品花色苷在該方法下重復(fù)性良好。

表2　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of repeatability test

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一份純化過(guò)膜樣品溶液，放置于室溫陰暗處，分別于0、1、2、4、8、12、18、24 h，按照1.2.1的方法測(cè)定樣品，矢車菊素-3-葡萄糖苷（B）和矢車菊素-3-蕓香糖苷（C）峰面積的RSD分別為1.58%和2.08%，見(jiàn)表3。表明樣品花色苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3Results of stability test

2.6回收率試驗(yàn)

在已知含量的樣品溶液中加入一定量的花色苷對(duì)照品，按照1.2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。矢車菊素-3-葡萄糖苷（B）和矢車菊素-3-蕓香糖苷（C）回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為：1.93%和2.40%。表明該方法具有較高的加標(biāo)回收率和精密度?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4Results of recovery ratio

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)三華李果實(shí)花色苷的主要成分進(jìn)行了定性和定量測(cè)定，顯示其花色苷為矢車菊素-3-葡糖糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷，含量分別為87.26 mg/kg和32.41 mg/kg，未檢出矢車菊素-3-半乳糖苷。本試驗(yàn)采用乙腈和甲酸水溶液做流動(dòng)相，分離效果較好。線性范圍0.000 5 mg/mL～0.1000 mg/mL，方法精密度良好，峰面積RSD小于等于1.07%。加標(biāo)回收率較高，RSD小于等于2.40%。樣品重復(fù)性好，進(jìn)樣峰面積RSD小于等于1.23%。表明方法簡(jiǎn)便可行，結(jié)果可靠，適用于三華李花色苷成分和含量的測(cè)定。

據(jù)報(bào)道［8］，矢車菊素-3-葡糖糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷在紫琥珀李果肉中的含量分別為：192.00、89.00 mg/kg；在大石早生李果肉中的含量分別為：82.00、4.00 mg/kg；在芙蓉李果肉中的含量分別為：37.00、49.00 mg/kg。在紅樹(shù)莓中的含量分別為354.27、318.99 mg/kg［12］；野生桑葚的含量分別為1041.63、482.71 mg/kg［13］。三華李矢車菊素-3-葡糖糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷的含量低于紫琥珀李，高于大石早生李和芙蓉李，低于紅樹(shù)莓和桑葚?；ㄉ帐且环N天然安全色素，具有抗氧化等多種作用，三華李在廣東省廣泛種植，平均產(chǎn)量達(dá)22 500 kg/hm2～37 500 kg/hm2，果實(shí)花色苷含量較高，具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

［1］肖仔君，鐘瑞敏，許曉春，等.三華李果渣食用色素提取及其穩(wěn)定性研究［J］.食品與機(jī)械，2010，26（2）：27-32

［2］Willemse C M，Stander M A，Tredoux A G J，et al.Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromato-graphic Analysis of Anthocyanins［J］.Journal of Chromatography A，2014，1359（12）：189-201

［3］董桂紅，劉延吉.三華李花色苷對(duì)D-半乳糖致衰小鼠皮膚組織的抗氧化作用［J］.食品工業(yè)，2011，33（11）：94-96

［4］Xia X，Ling W，Ma J，et al.An Anthocyanin-Rich Extract from Black Rice Enhances Atheroscl-erotic Plaque Stabilization in Apolipoprotein E-Deficient Mice［J］.The Journal of Nutrit-ion，2006，136（8）：2220-2225

［5］CACACE J E，MAZZA G.Optimization of extraction of anthocyanins from black currants with aqueous ethanol［J］.Food Science，2003，68（1）：240-248

［6］Luo L，Han B，Yu X，et al.Anti-Metastasis Activity of Black Rice Anthocyanins Against Breast Cancer：Analyses Using an ErbB2 Positive Breast Cancer Cell Line and Tumoral Xenograft Model［J］.Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2014，15（15）：6219-6225

［7］Schüller E，Halbwirth H，Mikulic-Petkovsek M，et al.High Concentrations of Anthocyanins in Genuine Cherry-Juice of Old Local Austrian Prunus Avium Varieties［J］.Food Chemistry，2015，173（15）：935-942

［8］張學(xué)英.李果實(shí)著色與花色素苷合成機(jī)理研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2008：31-33

［9］常虹.歐李花色苷的分離及其鑒定［J］.食品科學(xué)，2011，32（9）：59-63

［10］Yan Wang，Xiaoliu Chen，Yanmin Zhang，et al.Antioxidant Activities and Major Anthocyaninsof Myrobalan Plum（Prunus cerasiferaEhrh）［J］.Journal of Food Science，2012，77（4）：388-393

［11］劉劍利，劉曉，曹向宇.稠李花色苷的純化及體外抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2015，36（15）：5-6

［12］陳亮，辛秀蘭，王彥輝，等.紅樹(shù)莓花色苷含量測(cè)定及成分分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（5）：166-169

［13］陳亮，辛秀蘭，袁其朋.野生桑葚中花色苷成分分析［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（15）：307-310

Determination of Anthocyanin Component and Content in Sanhua Plum by HPLC

HUANG Yue，HUANG Wei*，LI Yuan
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China）

The Sanhua plum is rich in red pigment.Qualitative and quantitative determination of main composition of the red pigment were carred out.Then their structure and content were known，which can provide refer ence for Sanhua plum processing.The samples were detected with WondaSil C18 chromatographic column（4.6 mm×250mm，5microns）under40℃columntemeratureand520nmdetectionwavelength.Themobilephase consisted of acetonitrile（A）and 4%formic acid aqueous solution（B）with linear gradient program of 6%-16%（A）in0min-25min，ataflowrateof1mL/min.Cyanin-3-glucosideandcyanin-3-rutinosidecontentsofSanhua plum were 87.26 mg/kg and 32.41 mg/kg，cyanin-3-galacoside was not checked out.The calibration curves of cyanidin-3-glucoside and cyanin-3-rutinoside were linear in the range of 0.000 5 mg/mL-0.100 0 mg/mL，with 0.999 9 and 0.999 8 R2respectively.Standard addition recovery rate is more than 95%and relative standard deviation were 1.93%and 2.40%respectively.Sample relative standard deviation of peak area is less than or equal to 1.23%，which showed good repeatability.This method is simple and reliable.It's suitable to detect anthocyanins component and content in San hua plum.

Sanhuaplum；anthocyanin；highperformanceliquidchromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.028

2015-03-09

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD31B03）

黃月（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品加工、包裝與保藏。

黃葦（1967—），女，教授，研究方向：食品加工、包裝與保藏。