恩諾沙星可視化凝膠柱快速免疫檢測(cè)方法研究

生威，吳雪寧，胡高爽，李詩(shī)潔，劉越，張燕，王碩

（教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

恩諾沙星可視化凝膠柱快速免疫檢測(cè)方法研究

生威，吳雪寧，胡高爽，李詩(shī)潔，劉越，張燕，王碩*

（教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

建立一種動(dòng)物源性食品中獸藥恩諾沙星可視化凝膠柱快速免疫檢測(cè)新方法。采用活化酯法制備恩諾沙星與辣根過(guò)氧化氫酶（HRP）的偶聯(lián)物作為酶標(biāo)抗原。整個(gè)檢測(cè)在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的1 mL SPE固相萃取柱中進(jìn)行，柱中包含兩層：一個(gè)結(jié)合了恩諾沙星特異性抗體的凝膠檢測(cè)層和一個(gè)結(jié)合了HRP抗體的凝膠質(zhì)控層。將樣品提取液與酶標(biāo)抗原預(yù)混合后加入到檢測(cè)柱中，基于抗原抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)和辣根過(guò)氧化物酶的酶促反應(yīng)，根據(jù)檢測(cè)柱的檢測(cè)層顏色的深淺和有無(wú)來(lái)定性半定量檢測(cè)恩諾沙星的含量。該凝膠檢測(cè)柱的檢測(cè)限為5 μg/L，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以在10 min內(nèi)完成，豬肉、牛肉、雞肉、魚(yú)肉、蝦肉和牛奶等動(dòng)物源性食品中恩諾沙星檢測(cè)限為100μg/kg。該方法具有準(zhǔn)確、靈敏、特異性好、操作簡(jiǎn)便快速、成本低等優(yōu)勢(shì)，適合動(dòng)物源性食品中恩諾沙星殘留的快速篩查。

恩諾沙星；凝膠柱；可視化檢測(cè)

恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）屬于喹諾酮類(lèi)抗菌藥，作為廣譜抗菌藥，對(duì)支原體、革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌等均具有抗菌作用。恩諾沙星在畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，但是由于不科學(xué)地使用這類(lèi)藥物導(dǎo)致其在動(dòng)物源性食品中殘留，影響人類(lèi)健康，使細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，進(jìn)而影響藥物在人類(lèi)疾病治療中的作用。目前用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中恩諾沙星殘留的方法主要有微生物法［1］、高效液相色譜法［2-3］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［4-5］、毛細(xì)管電泳法［6-7］、免疫分析法［8-10］等。儀器分析法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但檢測(cè)儀器昂貴、檢測(cè)步驟繁瑣，不適合快速檢測(cè)。免疫分析法特異性好、成本低、操作簡(jiǎn)單快速、結(jié)果判斷容易，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，特別是酶聯(lián)免疫試劑盒［11-12］和膠體金試紙條［13］檢測(cè)方法已經(jīng)在獸藥殘留檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。本研究旨在建立一種新型可視化免疫層析凝膠檢測(cè)柱用于動(dòng)物源性食品中恩諾沙星殘留的快速檢測(cè)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

恩諾沙星等喹諾酮類(lèi)獸藥：德國(guó)Dr公司；辣根過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫脲、3，3，5，5－四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N’-二環(huán)已基碳二亞胺（DCC）、二甲基甲酰胺（DMF）、Tris、甘氨酸、Proclin 300抑菌素：美國(guó)Sigma公司；β-環(huán)糊精、二甲基亞砜（DMSO）：德國(guó)Merck公司；CNBr-Sepharose 4B溴化氰活化瓊脂糖凝膠：美國(guó)GE公司；HPR抗體：北京莊盟生物技術(shù)公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、鹽酸、檸檬酸、醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；分析天平-BL610：德國(guó)賽多利斯公司；周轉(zhuǎn)式振搖器-MS2：美國(guó)IKA公司；旋渦混合器-HQ-60：北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司；燒結(jié)玻璃過(guò)濾器：天津盛博玻璃儀器有限公司；SPE柱（1 mL）、聚乙烯墊片、轉(zhuǎn)接頭：美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.3主要溶液

偶聯(lián)緩沖液（pH 8.3）：NaHCO34.2 g，NaCl 14.6 g，雙蒸水定容500 mL，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)其pH到8.3，4℃保存?zhèn)溆谩７忾]緩沖液（pH 8.0）：0.3 g甘氨酸溶于20 mL偶聯(lián)緩沖液中。平衡淋洗液（pH 4.0）：CH3COOH 0.58 mL，NaCl 2.92 g，雙蒸水定容100 mL，用1 mol/L的無(wú)水乙酸鈉調(diào)節(jié)其pH到4.0，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ苊浰嵋海╬H 3.0）：41.66 μL的濃鹽酸，雙蒸水定容到500 mL。底物液（TMB-過(guò)氧化氫脲溶液）：底物液A：無(wú)水醋酸鈉8.2 g，β-糊精2.5 g，過(guò)氧化氫脲428.6 mg，加雙蒸水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至5.0，4℃保存，使用時(shí)恢復(fù)至室溫。底物液B：100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存。使用前15 min混合，14.6 mL A溶液和0.45 mL B溶液。

1.4方法

1.4.1恩諾沙星酶標(biāo)抗原的制備

稱(chēng)取恩諾沙星半抗原8.9 mg溶于150 μL的無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中使其完全溶解，在攪拌狀態(tài)下加入3.5 mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和12.4 mg N，N'-二環(huán)已基碳二亞胺（DCC），室溫避光反應(yīng)4 h～6 h。溶液有渾濁物產(chǎn)生，離心（4℃，10 000 g，5 min）除去沉淀，在冰浴條件下將上層活化酯溶液緩慢逐滴加入到3 mL溶有10 mg HRP的碳酸氫鈉（130 mmol/L，pH 8.1）溶液中，4℃下攪拌反應(yīng)過(guò)夜，然后將反應(yīng)液吸出裝入透析袋，在4℃下用pH 7.4的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液透析3天，然后將透析液取出，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2封閉膠的制備

1）溶脹：稱(chēng)取1.00 g溴化氰活化瓊脂糖凝膠，加入到100 mL的配制好的HCl溶液中，攪拌溶脹10 min。

2）淋洗：將溶脹好的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到在具砂板層析柱中，再加入200 mL HCl淋洗，然后用偶聯(lián)緩沖液沖洗柱子，調(diào)節(jié)柱子pH至中性。

3）封閉：加入10 mL甘氨酸封閉液，密封柱子，室溫下震蕩反應(yīng)2 h。

4）清洗：首先加入10 mL的偶聯(lián)緩沖液淋洗1次，然后用10 mL的醋酸鈉緩沖溶液和10 mL的偶聯(lián)緩沖液分別沖洗。

5）貯存：待清洗液抽空，制備好的封閉膠用PBS 1∶3（體積比）懸起，約10 mL PBS（含有0.3 ml/L的抑菌素），放置于4℃保存待用。

1.4.3抗體膠的制備

1）溶脹：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.50 g溴化氰活化瓊脂糖凝膠，加入到50mL的配制好的HCl溶液中，攪拌溶脹10min。

2）淋洗：將溶脹好的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到在具砂板層析柱中，再加入200 mL HCl淋洗，然后用偶聯(lián)緩沖液沖洗柱子，調(diào)節(jié)柱子pH至中性，將淋洗液全部淋完。

3）偶聯(lián)抗體：取0.50 mg/mL抗體，用1 mL的偶聯(lián)緩沖液稀釋?zhuān)缓蠹尤氲皆诰呱鞍鍖游鲋校芊庵?，室溫下震蕩反?yīng)2 h。

4）封閉：加入10mL的偶聯(lián)緩沖液淋洗柱子，然后加入10mL的封閉液，再次密封柱子，室溫震蕩反應(yīng)2h。

5）清洗：首先加入10 mL的偶聯(lián)緩沖液淋洗1次，然后用10 mL的醋酸鈉緩沖溶液和10 mL的偶聯(lián)緩沖液分別沖洗。

6）貯存：待清洗液抽空，制備好的抗體膠用PBS 1∶3（體積比）懸起，約5 mL PBS（含有0.3 ml/L的抑菌素），放置于4℃保存待用。

1.4.4檢測(cè)柱的制備

質(zhì)控層是由HRP抗體膠與封閉膠以一定比例混合后，取150 μL混合膠加入到1 mL的SPE固相萃取柱中，用注射器活塞將PBS壓出。檢測(cè)層是由恩諾沙星抗體膠與封閉膠以一定的比例混合后，取150 μL加入其中，用注射器活塞將PBS壓出。檢測(cè)柱由下到上分別是質(zhì)控層和檢測(cè)層。將聚乙烯墊片加入1 mL的SPE固相萃取柱中，然后加入質(zhì)控層混合膠，加入第二層聚乙烯墊片，在質(zhì)控層上方約3 mm處加入第三層聚乙烯墊片，然后加入檢測(cè)層的混合膠，最后在頂部加入第四層墊片。

1.4.5檢測(cè)柱檢測(cè)步驟和檢測(cè)限

1）加樣：將1 mL按一定比例稀釋的酶標(biāo)記物與恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液混合液，通過(guò)進(jìn)樣口通過(guò)柱子，控制流速在2 min流完。

2）洗柱：用3 mL PBST由進(jìn)樣口加入沖洗柱子，再用2 mL PBS沖洗去除未與抗體結(jié)合的抗原與殘留的Tween-20。

3）顯色：從底端吸入300 μL底物液，反應(yīng)30 s后，用注射器活塞注入空氣，將底物液完全排出，繼續(xù)顯色3 min后，觀察顯色情況。

以檢測(cè)層顏色剛好消失時(shí)待測(cè)物的濃度定義為檢測(cè)柱的檢測(cè)限。

1.4.6實(shí)際樣品的檢測(cè)

豬肉、牛肉、雞肉、魚(yú)肉、蝦肉組織樣品和牛奶樣品處理方法如下：

組織：稱(chēng)取1 g勻漿好的組織樣品于15 mL離心管中，加1.6 mL乙腈，0.4 mL NaOH（0.1mol/L），3 000 r漩渦混勻2 min，離心（15℃，2 500 r/min，10 min），用pH 7.4PBS稀釋10倍。然后取1 mL的稀釋液與酶標(biāo)混合后，加入凝膠檢測(cè)柱進(jìn)行檢測(cè)。

牛奶：取1 mL牛奶樣品加入離心管中，用pH 7.4 PBS稀釋20倍，然后取1 mL的稀釋液與酶標(biāo)混合后，直接加入凝膠檢測(cè)柱進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)柱檢測(cè)條件的確定

為了縮短檢測(cè)時(shí)間，使檢測(cè)結(jié)果易于判斷，需要對(duì)質(zhì)控層HRP抗體膠的用量、檢測(cè)層恩諾沙星抗體膠的用量、酶標(biāo)記物稀釋度、抗原抗體結(jié)合反應(yīng)時(shí)間和酶催化底物反應(yīng)時(shí)間等檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而達(dá)到快速可視化檢測(cè)的目的。

經(jīng)優(yōu)化試驗(yàn)，質(zhì)控層HRP抗體膠與封閉膠用量比為1∶49（體積比），檢測(cè)層恩諾沙星抗體膠與封閉膠用量比為1∶14（體積比），酶標(biāo)記物稀釋倍數(shù)為1∶100 000，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)時(shí)間為2 min，酶催化底物反應(yīng)時(shí)間為3 min，此條件下的檢測(cè)層與質(zhì)控層顯色后顯現(xiàn)出清晰的藍(lán)色，且質(zhì)控層和檢測(cè)層顏色一致，如圖1所示，圖中上層為檢測(cè)層，下層為質(zhì)控層。

2.2檢測(cè)柱檢測(cè)限的確定

可視化凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)恩諾沙星結(jié)果如圖2所示。

如圖2所示，使用檢測(cè)柱分別檢測(cè)濃度為0、1、2、5 μg/L的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，當(dāng)恩諾沙星濃度為0 μg/L時(shí)，檢測(cè)柱的質(zhì)控層和檢測(cè)層顏色一致，而隨著恩諾沙星濃度的增加，檢測(cè)層的顏色逐漸變淺，當(dāng)恩諾沙星濃度為5 μg/L時(shí)，檢測(cè)柱的檢測(cè)層顏色完全消失，因此確定該免疫凝膠檢測(cè)柱的檢測(cè)限為5 μg/L。

圖1　檢測(cè)柱檢測(cè)條件優(yōu)化Fig.1Optimization of the gel test column

圖2　可視化凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)恩諾沙星Fig.2Detection of enrofloxacin with the visual gel test column

2.3方法特異性

使用恩諾沙星凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)時(shí)，當(dāng)恩諾沙星濃度為5 μg/L時(shí)，檢測(cè)柱的檢測(cè)層顏色完全消失。對(duì)于其他喹諾酮類(lèi)獸藥和其他種類(lèi)的獸藥，當(dāng)其濃度達(dá)到500 μg/L時(shí)，檢測(cè)柱的檢測(cè)層仍會(huì)出現(xiàn)明顯的藍(lán)色，方法與其他藥物沒(méi)有交叉反應(yīng)，說(shuō)明使用此凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)恩諾沙星殘留具有很好特異性。

2.4實(shí)際樣品的檢測(cè)

豬肉、牛肉、雞肉、魚(yú)肉、蝦肉和牛奶樣品分別添加最終濃度為0、20、40、100 μg/kg的恩諾沙星。添加后的樣品經(jīng)過(guò)1.4.6所提到的方法處理后直接用于凝膠檢測(cè)柱進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

檢測(cè)沒(méi)有添加恩諾沙星的動(dòng)物源性食品樣品的檢測(cè)柱的質(zhì)控層和檢測(cè)層顏色一致，而隨著恩諾沙星添加濃度的增加，檢測(cè)層的顏色逐漸變淺，當(dāng)恩諾沙星添加濃度為100 μg/kg時(shí)，檢測(cè)柱的檢測(cè)層顏色完全消失，因此確定該免疫凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)豬肉、牛肉、雞肉、魚(yú)肉、蝦肉和牛奶等動(dòng)物源性食品樣品的檢測(cè)限為100 μg/kg。

圖3　可視化凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)動(dòng)物源性食品中恩諾沙星Fig.3Detection of enrofloxacin in animal-derived foods with the visual gel test column

3結(jié)論

本研究建立了一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中獸藥恩諾沙星殘留的新型可視化免疫凝膠柱方法。該凝膠檢測(cè)柱方法的檢測(cè)限為5 μg/L，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以在10 min內(nèi)完成，針對(duì)動(dòng)物源性食品的恩諾沙星檢測(cè)限為100 μg/kg。該方法成本低，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果判斷容易，只需根據(jù)檢測(cè)柱的檢測(cè)層顏色深淺和顏色有無(wú)就可以定性或半定量檢測(cè)恩諾沙星的含量，適合動(dòng)物源性食品中恩諾沙星殘留的快速篩查。

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Development of A Gel-based Rapid Visual Immunoassay for the Detection of Enrofloxacin

SHENG Wei，WU Xue-ning，HU Gao-shuang，LI Shi-jie，LIU Yue，ZHANG Yan，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

A new gel-based visual immunoassay was developed for the rapid screening of enrofloxacin residues in animal-derived foods.The enrofloxacin was conjugated to HRP accordig to the active ester method.Thegelbased test column in an empty SPE cartridge（1 mL）consisted of a test layer containing anti-enrofloxacin antibody coupled gel，and a control layer with anti-HRP antibody coupled gel.Based on the direct competitive immuno-reaction and the horseradish peroxidase enzymatic reaction，the test results could be evaluated visually according as color development.The limit of detection（LOD）of this gel-based immunoassay was 5 μg/L and the whole procedure was completed within 10 min.The LODs of this assay for enrofloxacin in animal-derived foods were 100 μg/kg.The gel-based visual immunoassay allows for accurate，sensitive，specific，rapid，and lowcost detection of enrofloxacin residues in animal-derived foods.

enrofloxacin；geltestcolumn；visualdetection

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.027

2015-11-12

“十二五”國(guó)家科技計(jì)劃課題（2012BAD28B05）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（13JCQNJC15300）；國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2014DFR30350）

生威（1980—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品安全檢測(cè)。