杜香多糖的乙醇分級(jí)純化及其性質(zhì)研究

張喬會(huì)，黃晶晶，田盼盼，王建中，羅興武，*

（1.湖北民族學(xué)院科技學(xué)院，湖北恩施445000；2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

杜香多糖的乙醇分級(jí)純化及其性質(zhì)研究

張喬會(huì)1，2，黃晶晶1，田盼盼1，王建中2，羅興武1，*

（1.湖北民族學(xué)院科技學(xué)院，湖北恩施445000；2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

利用乙醇分級(jí)沉淀法提取純化杜香多糖，采用不同濃度的乙醇（25%、45%、65%、85%和95%）沉淀；采用紅外光譜檢測(cè)多糖組分的基團(tuán)組成，采用電子掃描顯微鏡檢測(cè)多糖組分的外部形態(tài)，利用高效陰離子色譜法分析各多糖的單糖組分，并利用熱重及X射線衍射分析各組分的物理特征。不同濃度乙醇分級(jí)沉淀得到5種多糖組分，各組分在SEM下沒(méi)有固定形狀，紅外檢測(cè)都具有多糖的典型基團(tuán)，各組分單糖組成差別明顯，但都以葡萄糖、半乳糖等為主。a、b、c、d和e 5種多糖的失重率分別是90.1%、72.6%、67.3%、57.4%和55.4%，結(jié)晶度分別為10.8%、1.7%、2.1%、3.5%和4.3%。

杜香；多糖；分級(jí)沉淀；理化性質(zhì)

杜香（Ledum palustre L.）為杜香屬的常綠灌木［1］，其在大興安嶺70%的區(qū)域都有分布［2］。大興安嶺地區(qū)干葉年生產(chǎn)量可達(dá)536 925 t［3］。杜香枝葉含有粗油、多糖和熊果酸等成分［4-7］。

多糖具有抗氧化［8］、抗腫瘤［9］、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫［10］、抗血栓［11］和降血糖［12］等作用，其提取多采用水提醇沉，輔以超聲［13］、微波［14-15］、酶法［16］和超高壓［17］等方法，而分離純化主要采用纖維素柱層析［18-19］和透析［20］等方法。目前針對(duì)杜香多糖的研究較少，多見(jiàn)進(jìn)行粗多糖提?。?1］的研究。本研究用水提法進(jìn)行粗多糖提取，利用不同濃度醇溶液析出不同分子量多糖的原理，得到杜香多糖初步分離。另外，采用高效陰離子色譜法簡(jiǎn)便、高效地分析了各杜香多糖組分的單糖組成，并利用熱重及X射線衍射分析了各組分的物理性質(zhì)，為其進(jìn)一步研究利用提供了基礎(chǔ)參考。隨著保健品市場(chǎng)的活躍，杜香資源開(kāi)發(fā)備受關(guān)注，而研究杜香多糖各組分及其性質(zhì)等對(duì)于杜香的綜合開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料與試劑

杜香采自內(nèi)蒙古金河，自然風(fēng)干，磨粉，過(guò)40目篩，備用。

無(wú)水乙醇、石油醚、蒽酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：北京化工廠；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（鼠李糖，半乳糖，阿拉伯糖，葡萄糖，甘露糖，木糖，半乳糖醛酸，葡萄糖醛酸）（純度≥99%）：SigmaChem. Co.；98%濃硫酸：北京化工廠；去離子水；超純水。

1.2儀器

KQ-500E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡、E-1010型濺射鍍膜機(jī)：日本日立公司；MILLI-Q Advantage A10型超純水機(jī)：美國(guó)密理博公司；RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ICS-3000型雙系統(tǒng)離子色譜儀（包括AS50自動(dòng)進(jìn)樣器）：美國(guó)戴安公司；Tensor27型紅外光譜儀：德國(guó)Bruker公司。

1.3方法

1.3.1杜香多糖的提取方法

采用水提醇沉法。準(zhǔn)確稱取一定量的杜香枝葉粉末，按質(zhì)量比1∶20加入去離子水，利用閃式提取器輔助提取4 min，放入恒溫水浴震蕩箱中震蕩2 h，離心分離液體和固體粉末，得到杜香多糖提取液。

1.3.2杜香多糖的分級(jí)沉淀方法

根據(jù)不同分子量多糖在不同濃度醇中溶解度不同的原理分級(jí)純化杜香多糖，見(jiàn)圖1。

圖1　杜香多糖的分級(jí)沉淀流程圖Fig.1Flow-process diagram of fractional precipitation of Ledum polysaccharide

如圖1所示，即向得到的多糖混合提取液中加入乙醇，依次調(diào)節(jié)液體中乙醇濃度分別為25%、45%、65%、85%和95%。每調(diào)節(jié)一次濃度后，將液體放置于4℃冰箱中靜置1 h，然后分離固液兩相，固體進(jìn)行下一步純化操作，液體則繼續(xù)加入無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)成下一個(gè)濃度。

1.3.3杜香多糖的純化方法

多糖一般可能會(huì)與一些蛋白結(jié)合形成糖苷、糖蛋白等，也可能含有一定的脂溶性成分，為得到純度較高的樣品，必須對(duì)樣品進(jìn)行純化處理。主要采用有機(jī)溶解萃取法進(jìn)行脫脂肪，即得到的樣品加入一定量的石油醚處理一定時(shí)間進(jìn)行萃取，濾去石油醚，將濾渣溶解于一定量的去離子水中，加入酒精至濃度為分級(jí)沉淀時(shí)液體濃度，放置于4℃冰箱中靜置1 h，然后分離固液兩相，重復(fù)上述操作4次。把前一步得到的固體全部溶解于去離子水中，采用Sevage法進(jìn)行脫蛋白處理，即按多糖液∶氯仿∶丁醇為16∶4∶1（體積比）加入脫蛋白試劑，在振蕩器上振蕩30 min，除去固體，液體繼續(xù)脫蛋白直到無(wú)固體析出。除去糖液中的有機(jī)溶劑，加入乙醇調(diào)節(jié)液體濃度為分級(jí)沉淀時(shí)液體濃度，放置于4℃冰箱中靜置1 h，除去液體，把得到的固體冷凍干燥，便可得到杜香多糖樣品。

1.3.4杜香多糖的紅外分析

取少量樣品置于紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定，掃描分辨率2 cm-1，掃描范圍為4 000 cm-1～400 cm-1，掃描次數(shù)32次。

1.3.5杜香多糖的高效陰離子色譜分析

1.3.5.1杜香粗多糖的水解

稱取樣品4 mg～6 mg放于玻璃瓶中，加入0.125 mL 72%硫酸溶液和1.35 mL超純水后放置于105℃烘箱中反應(yīng)2.5 h，其間每30 min搖晃一次，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行過(guò)濾（0.45 μm），取少量過(guò)濾液體稀釋50倍，備用。

1.3.5.2混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備

分別稱取一定量的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖配、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸制成混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液備用。

1.3.5.3離子色譜分析

取水解釋完成并稀釋后的樣品及標(biāo)準(zhǔn)品用高效陰離子色譜儀進(jìn)行檢測(cè)分析，采用梯度淋洗。檢測(cè)條件如下：色譜柱：Dionex CarboPacTMPA20分析柱（4 mm× 250 mm），CarboPacTMPA20保護(hù)柱（3 mm×30 mm）；檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)溫度：30℃；進(jìn)樣體積：25 μL；淋洗液梯度程序見(jiàn)表1。

表1　淋洗液的梯度程序Table 1Gradient of eluent

1.3.6多糖樣品的熱重、XRD分析及SEM分析

多糖樣品的熱重分析、XRD檢測(cè)及SEM分析參照Pang等方法［22］進(jìn)行，考察其熱穩(wěn)定性及結(jié)晶情況。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel及Origin軟件整理數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1杜香多糖的提取及分級(jí)純化

向多糖提取液中加入乙醇并分別調(diào)節(jié)液體中乙醇濃度為25%、45%、65%、85%和95%。依次分離得到5個(gè)多糖組分，記為多糖a、b、c、d和e，5個(gè)組分顏色逐漸變淺，多糖a顏色為深灰色，多糖b和多糖c顏色分別為灰色和淺灰色，多糖d的顏色則變?yōu)榈S白色，多糖e接近白色。

2.2杜香多糖組分的紅外分析

杜香多糖組分的紅外分析圖見(jiàn)圖2。

圖2　5種杜香多糖的紅外譜圖Fig.2IR spectrum of five kinds of Ledum polysaccharide

從圖2可以看出，a、b、c、d和e這5種多糖成分所含基團(tuán)差異不大，都在3380cm-1、1 800 cm-1～1 600 cm-1、1 450 cm-1、1 109 cm-1～1 040 cm-1和1 040 cm-1等處具有特征吸收峰，說(shuō)明其含有O-H、C=O、CH2及葡萄糖結(jié)構(gòu)等多糖結(jié)構(gòu)的典型基團(tuán)。但a和b兩種多糖在2 900 cm-1處具有特征吸收峰，說(shuō)明其可能含有CH3結(jié)構(gòu)。5種多糖都具有多糖的典型基團(tuán)，說(shuō)明利用乙醇分級(jí)沉淀法分離得到的物質(zhì)是多糖。

2.3杜香多糖組分的單糖組成分析

5種杜香多糖組分的離子色譜分析圖見(jiàn)圖3。

根據(jù)高效陰離子色譜分析及與單糖混合樣品離子色譜圖f比對(duì)可知，杜香多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸組成，且以葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸為主。5個(gè)組分具體的單糖組成如表2所示。

當(dāng)乙醇濃度為45%時(shí)，分離得到的多糖組分的單糖組成最為復(fù)雜，含有8種單糖，而乙醇濃度較高時(shí)分離得到的多糖組分其單糖組成相對(duì)簡(jiǎn)單，只含有半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸等幾種單糖。

圖3　5種杜香多糖的離子色譜圖Fig.3Ion chromatogram of five kinds of Ledum polysaccharide

表2　5種杜香多糖的單糖組成Table 2Monosaccharide component of five kinds of Ledum polysaccharide

2.4杜香多糖組分的熱重分析

5種杜香多糖組分的失重結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　杜香多糖失重圖（氮?dú)獗Ｗo(hù)）Fig.4TGA analysis of Ledum polysaccharide（under N2condition）

從圖4中失重曲線可以得出，5種杜香多糖組分都經(jīng)歷兩次失重過(guò)程，一次比較輕微，后一次十分顯著，這可能與多糖的吸水性、組成和聚集態(tài)等有關(guān)。第一次失重出現(xiàn)在100℃以內(nèi)，失重率為1.50%，這有可能是因?yàn)槎嗵蔷哂形裕樟艘欢ǖ目諝庵械乃?，在加熱情況下失去水分從而失重明顯；第二個(gè)失重出現(xiàn)在200℃后，a、b、c、d和e 5種多糖的失重率分別是90.1%、72.6%、67.3%、57.4%和55.4%，試驗(yàn)后坩堝內(nèi)的粉末顏色依次為灰色、灰色、黑灰相間、黑色和黑色。此溫度區(qū)間內(nèi)，5種多糖組分的失重率比重大，說(shuō)明在該溫度范圍內(nèi)，幾種多糖組分發(fā)生了劇烈的分解反應(yīng)，反映了杜香多糖在200℃以上時(shí)是不穩(wěn)定的。

2.5杜香多糖組分的X射線衍射分析

杜香多糖組分的X衍射強(qiáng)度曲線圖見(jiàn)圖5。

圖5　5種杜香多糖的X衍射強(qiáng)度曲線圖Fig.5XRD intensity curves of five kinds of Ledum polysaccharide

由圖5可以看出，杜香多糖的X射線衍射強(qiáng)度曲線最高峰出現(xiàn)的2θ位置大致在15°～25°之間，除a峰形尖利以外，b、c、d和e峰形十分圓頓，基本呈現(xiàn)典型饅頭峰的特性。a、b、c、d和e的結(jié)晶度分別為10.8%、1.7%、2.1%、3.5%和4.3%。

2.6杜香多糖組分的電鏡掃描分析

杜香多糖組分的電鏡掃描圖見(jiàn)圖6。

圖6　杜香多糖的掃描電鏡圖（放大3 000倍）Fig.6ScanningPictureofLedumpolysaccharidebySEM（3000X）

從以上電鏡掃描圖可以看出，冷凍干燥后的杜香多糖沒(méi)有固定的形態(tài)，由于冷凍干燥的原因，整體結(jié)構(gòu)類似海綿。這也符合多糖沒(méi)有固定結(jié)構(gòu)的特性。

3結(jié)論與討論

共獲得5種不同的多糖組分，各組分在掃描電鏡下沒(méi)有固定形狀。紅外檢測(cè)都具有多糖的典型基團(tuán)，各組分單糖組成差別明顯，但都以葡萄糖和半乳糖等為主。a、b、c、d和e 5種多糖的失重率分別是90.1%、72.6%、67.3%、57.4%和55.4%，且其失重率呈遞減趨勢(shì)，用越高濃度乙醇析出的多糖，失重程度越低，這可能是因?yàn)橛酶邼舛纫掖嘉龀龅亩畔愣嗵蔷哂懈鼜?fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，或者具有更長(zhǎng)的碳鏈，從而使得其對(duì)熱等作用具有更強(qiáng)的抵抗能力。a、b、c、d和e 5種多糖的結(jié)晶度分別為10.8%、1.7%、2.1%、3.5%和4.3%。除a外，結(jié)晶度隨著析出液濃度增加而細(xì)微增加。這可能是隨著析出多糖的乙醇濃度升高，分子量越大的多糖被逐級(jí)析出，而分子量越大，分子空間構(gòu)象越復(fù)雜多樣，內(nèi)部也越有可能形成晶形或者相互間越有可能形成穩(wěn)定晶體，而a則可能是由于沒(méi)有完全純化，含有微量的鹽等造成其結(jié)晶度高于其它組分。

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Ethanol Fractional Purification and Characterization of Polysaccharides from Ledum

ZHANG Qiao-hui1，2，HUANG Jing-jing1，TIAN Pan-pan1，WANG Jian-zhong2，LUO Xing-wu1，*
（1.Science and Technology College of Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，Hubei，China；2.Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Polysaccharides were extracted from Ledum by the method of water extraction and deposited by various concentrations of ethanol which were 25%，45%，65%，85%and 95%.The morphological characteristics of each polysaccharide component were detected by infrared and electron scanning microscopy.High performance anion chromatography was used for monosaccharide composition analysis.The physical characteristics of each polysaccharide component were known by thermo gravimetric and X ray diffraction analysis.As a result，five different polysaccharide fractions were obtained，and they have no fixed shapes in the SEM and have the typical groups of polysaccharides by infrared analysis.The composition of monosaccharide in each polysaccharide was various，but they were mainly composed of glucose，galactose，and so on.The weight loss rates of a，b，c，d，e polysaccharides were 90.1%，72.6%，67.3%，57.4%and 55.4%，respectively.Each degree of crystallization was separately 10.8%，1.7%，2.1%，3.5%and 4.3%.

Ledum；polysaccharide；fractionalprecipitation；physicochemicalproperty

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.025

2015-11-13

湖北民族學(xué)院科技學(xué)院科研課題（KJZ201601）；湖北省教育廳科研項(xiàng)目（B2014237）作者簡(jiǎn)介：張喬會(huì)（1986—），男（土家），助教，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取利用。

羅興武（1978—），男（土家），副教授，研究方向：食品機(jī)械及天然產(chǎn)物提取。