響應面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取工藝

王田林，梁新紅，孫俊良，莫海珍，周蒙

（河南科技學院食品學院，河南新鄉(xiāng)453003）

響應面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取工藝

王田林，梁新紅，孫俊良*，莫海珍，周蒙

（河南科技學院食品學院，河南新鄉(xiāng)453003）

采用新鮮的番木瓜為原料，探究超濾法提取木瓜蛋白酶的最佳工藝條件，選定L-cys、EDTA、溫度、壓力、時間、物料濃度6個因素進行單因素試驗，確定超濾法提取木瓜蛋白酶的較佳工藝條件，其中L-cys和EDTA為木瓜蛋白酶的保護劑，其濃度分別在0.04 mol/L和0.002 mol/L時對木瓜蛋白酶的酶活性保護最強。選定超濾過程中的溫度、壓力、時間、物料濃度4個條件進行響應面試驗，建立數(shù)學模型，然后回歸分析，模型評價，結(jié)果表明超濾法提取木瓜蛋白酶的最佳條件為：溫度55℃，壓力0.25 MPa，時間3.7 min，物料濃度30%，此時酶活性大小為（9.31±0.27）萬單位/mg，與模型驗證的酶活性9.355萬單位/mg非常接近。說明響應面法能較好的用于木瓜蛋白酶提取工藝的優(yōu)化。

木瓜蛋白酶；超濾；響應面分析

木瓜蛋白酶是一類半胱氨酸蛋白酶，又可以稱為木瓜酶，儲藏在番木瓜的果實和根、莖、葉內(nèi)，在未成熟的乳汁中含量最為豐富［1-2］。它也屬于一種蛋白水解酶，分子量為27 000 u，由一種單肽鏈組成，含有212個氨基酸殘基，至少有3個氨基酸殘基存在于酶的活性中心部位，他們分別是Cys25、His159和Asp158，六個半胱氨酸殘基形成了三對二硫鍵，但都不存在酶活性部位［3］。木瓜蛋白酶的結(jié)構(gòu)組成決定了其有較強的合成能力和蛋白酶水解能力，具有穩(wěn)定性好、耐高溫、活性強的特點［4］，此外還具有溶菌活力、解脂和凝乳等優(yōu)點。由于木瓜蛋白酶可以進行酶促反應，利用這一特性，可把大分子的蛋白質(zhì)水解成容易消化吸收的小分子多肽或氨基酸，因此在食品（豆類、肉類食品、啤酒工業(yè)）、輕紡、醫(yī)學等領域有著廣泛的應用。

木瓜蛋白酶的粗提，是指在種植的番木瓜未成熟果實中割取乳液去雜，在室溫（20℃～25℃）下加入半胱氨酸溶液，放在研缽里研磨均勻，靜置一段時間取上清液即為粗制酶，它的水溶液呈混濁狀，然后在離心去雜的上清液中加入（NH4）2SO4分級分離得沉淀，加入半胱氨酸溶液后經(jīng)鹽析重結(jié)晶干燥得精制酶。木瓜蛋白酶室溫貯存活力穩(wěn)定性與活力高低呈反比，活力越高下降越快。在正常情況下，酶使用時活力有時會下降的主要因素為干燥失重、溫度和空氣氧化。粗制酶酶活比精制酶酶活穩(wěn)定，熱風吹干和噴霧干燥的酶酶活比冷凍干燥的酶酶活穩(wěn)定，因此酶的儲存應放在低于10℃的環(huán)境中［5-13］。為了防止木瓜蛋白酶失活，可以加入適量保護劑如EDTA、L-cys、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉等，如果用于醫(yī)藥行業(yè)，則需進一步純化，一般采用（NH4）2SO4、Spsephade×柱層析，齊杰等［14］采用的Spsephade×G100凝膠層析則效果更為明顯。

天然的木瓜蛋白酶在極端pH、重金屬離子、高溫等條件下，易遭到破壞，使酶在生產(chǎn)和使用遭到極大的限制。人們對如何提高酶的活性及其穩(wěn)定性越來越重視。近年來，人們經(jīng)過努力找到了許多木瓜蛋白酶酶的提取方法。如今木瓜蛋白酶提取分離技術主要有超濾法、鹽析法、親和層析法、絮凝法和有機溶劑法等。鹽析法提取的木瓜蛋白酶活性較低；有機溶劑法提取的木瓜蛋白酶易變性以及有機溶劑殘留問題；絮凝法提取專一性不強，制得的木瓜蛋白酶純度不高；親和層析法提取的酶純度雖然較高，但是操作復雜，不易在工業(yè)上放大生產(chǎn)，且用于親和層析的前處理液需是經(jīng)過初步純化的酶液［15-20］。相對來說，超濾法能有效分離提取高純度木瓜蛋白酶。其原因是由于超濾法易于連續(xù)化操作，目標產(chǎn)物有較高的收率，分離過程經(jīng)濟等優(yōu)勢，因此被廣泛應用［21］。本試驗首先驗證了兩種保護劑（L-cys和EDTA）在超濾法提取木瓜蛋白酶工藝中的作用，然后采用響應面法優(yōu)化超濾法提取木瓜蛋白酶工藝的參數(shù)（提取時間、提取溫度、物料濃度、壓力），為木瓜蛋白酶提取產(chǎn)量的提高奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

番木瓜由水果超市買入（品種：青番木瓜）；木瓜蛋白酶（酶活10 U/mg）：美國Sigma公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸：上海寶曼生物科技有限公司；其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

Vivaflow型切向流超濾機：德國STRTORIOUS公司；全波長多功能酶標儀：美國賽非默世爾公司；DZKW-4型恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；FA124型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3超濾法提取木瓜蛋白酶的工藝

新鮮青番木瓜→取皮切碎→加冰水搗碎→過濾→取濾液離心10 min（10 000 r/min）→取上清液→加入酶活保護劑→調(diào)pH→靜置預處理3 h→預處理液真空抽濾→超濾。

1.4測定酶的活性

酶活力單位定義：在規(guī)定條件下，1 min內(nèi)酶水解酪蛋白釋放出相當于1 μg/mL酪氨酸在275 nm波長處的吸收度為1個活力單位。以0.1 mol/L鹽酸溶液作空白，在275 nm波長處測定空白溶液，待測定液，對照品溶液的吸光度。

酶活力計算［22］：

按下式計算酶活力：

每1 mg木瓜蛋白酶活力單位=A/As×Cs×12/2×稀釋倍數(shù)/W（1）

式中：A為待測定液的吸光度減去空白溶液的吸光度；As為對照品溶液的吸光度；Cs為酪氨酸對照品溶液的濃度，μg/mL；W為樣品重量，mg。

木瓜蛋白酶1個活力單位相當于釋放1 μg的酪氨酸。規(guī)定酶濃度為1 mL測定液釋放40 μg的酪氨酸。

1.5試驗設計

首先對木瓜蛋白酶的兩種酶保護劑L-cys和EDTA的濃度大小設計單因素試驗，然后再設計單因素試驗分別對木瓜蛋白酶提取條件：超濾時間、壓力、pH、物料濃度（物料質(zhì)量和加水量的百分比）進行考察，探究其對木瓜蛋白酶活性的影響。然后采用響應面法優(yōu)化以上4個因素，在單因素試驗基礎上設計響應面參數(shù)表，試驗因素水平表見表1。應用Design Expert 7.0軟件對結(jié)果進行分析。

表1　響應面試驗因素水平編碼表Table 1Factors and levels of response surface experiment

2結(jié)果與分析

2.1預處理過程中酶活保護劑L-cys和EDTA添加量對木瓜蛋白酶活性的影響

準確量取一定量的濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mol/L的L-cys及濃度為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 mol/L的EDTA分別加入到離心后的濾液中，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0后靜置3 h，抽濾后進行超濾，用多功能酶標儀在260 nm波長下測吸光值按（1）式求酶活。

提取中添加不同濃度L-cys對木瓜蛋白酶活性的影響見圖1，提取中添加不同濃度EDTA對木瓜蛋白酶活性的影響見圖2。

圖1　提取中添加不同濃度L-cys對木瓜蛋白酶活性的影響Fig.1Extraction of adding different concentration of L-cys effect on the activity of papain

圖2　提取中添加不同濃度EDTA對木瓜蛋白酶活性的影響Fig.2Extracting of adding different concentration of EDTA effect on the activity of papain

從圖1可以看出在預處理過程中，L-cys濃度為0.04 mol/L，pH為7.0的情況下，EDTA濃度為0.002 mol/L時對木瓜蛋白酶活性能起到很好的保護作用。從圖2可以看出，在預處理過程中，EDTA濃度0.002 mol/L、pH為7.0的情況下，L-cys添加量為0.04 mol/L時對木瓜蛋白酶活性能起到較好的保護作用。

2.2超濾過程中壓力對木瓜蛋白酶活性的影響

試驗研究超濾過程中預處理液體積100 mL，其中物料濃度為30%，溫度為50℃，操作壓力分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 MPa，反應時間為5 min時對木瓜蛋白酶活性的影響。提取中不同壓強對木瓜蛋白酶活性的影響見圖3。

由圖3可知，隨著壓力的增大，木瓜蛋白酶的活性明顯上升，但到了0.25 MPa以后，隨著壓力的繼續(xù)增加，木瓜蛋白酶的活性呈現(xiàn)下降趨勢。操作壓力對超濾結(jié)果影響很大，所以壓力控制在0.25 MPa左右酶的活性最大。

圖3　提取中不同壓強對木瓜蛋白酶活性的影響Fig.3Extraction in different pressure effect on the activity of papain

2.3超濾過程中溫度對木瓜蛋白酶活性的影響

試驗研究超濾過程中預處理液體積100 mL，其中物料濃度為30%，操作壓力為0.25 MPa，反應溫度分別為35、45、55、65、75、85℃，反應時間為5.5 min時對木瓜蛋白酶活性的影響。提取中不同溫度對木瓜蛋白酶活性的影響見圖4。

圖4　提取中不同溫度對木瓜蛋白酶活性的影響Fig.4Extract in different temperature effect on the activity of papain

由圖4可知，在超濾過程中，木瓜蛋白酶活性隨著溫度的升高而有所增大，溫度的升高減少了溶劑的粘度從而加大了溶液的滲透能力，但當溫度高于55℃，由于過高的溫度能使酶失活，木瓜蛋白酶的活性開始下降。所以溫度控制在55℃左右時酶的活性最大。

2.4超濾過程中時間對木瓜蛋白酶活性的影響

試驗研究超濾過程中預處理液體積100 mL，其中物料濃度為30%，反應溫度55℃，操作壓力0.25 MPa，反應時間分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 min時對木瓜蛋白酶活性的影響，提取中不同時間對木瓜蛋白酶活性的影響見圖5。

由圖5可知，在一定壓力、溫度和物料濃度的情況下，1.5 min～3.5 min之間隨著提取時間的增加酶活性逐漸增加，3.5 min后隨著時間的增加酶活緩慢的下降，由此可得超濾時間控制在3.5 min左右比較合適。

2.4超濾過程中物料濃度對木瓜蛋白酶活性的影響

圖5　提取中不同時間對木瓜蛋白酶活性的影響Fig.5Extraction effect on the activity of papain in a different time

試驗研究超濾過程中預處理液體積100 mL，其中反應溫度55℃，操作壓力0.25MPa，反應時間為3.5 min，木瓜蛋白酶液的質(zhì)量分數(shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%時對木瓜蛋白酶活性的影響，不同濃度的木瓜蛋白對酶活性的影響見圖6。

圖6　不同濃度的木瓜蛋白對酶活性的影響Fig.6Different concentrations of papaya protein effect on enzyme activity

由圖6可知，木瓜蛋白酶的活性隨著木瓜濾液的濃度增大而增大，當物料濃度為30%時，木瓜蛋白酶的活性最大，隨著濾液濃度的增加，濃度差顯著，酶的提取速率減慢，酶的活性逐漸降低。因此，超濾過程中木瓜濾液的物料濃度控制在30%時，酶的活性最高。

2.5響應面試驗優(yōu)化木瓜蛋白酶的工藝參數(shù)

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，綜合比較影響提取木瓜蛋白酶過程中酶活的較大的4個條件的最優(yōu)值，超濾溫度55℃，壓力0.25 MPa，時間3.5 min，物料濃度30%。以木瓜蛋白酶的活性大小為指標，采用Design Expert 7.0軟件設計分析。結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken試驗設計與結(jié)果Table 2Experimental design and results of Box-Behnken

續(xù)表2Box-Behnken試驗設計與結(jié)果Continue table 2Experimental design and results of Box-Behnken

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)，用Desgin Expert 7.0程序進行二次多項式回歸，回歸模型方程為：Y=9.25-0.25A+0.15B+ 0.79C+0.02D+0.14AB+0.44AC+0.037AD+0.18BC+ 0.045BD+0.043CD-0.7A2-0.2B2-2.62C2-0.4D2

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

表3　響應面回歸方程方差分析Table 3ANOVA for response surface quadratic model

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1極其顯著，失擬項P=0.136 1不顯著，表明回歸方程擬合程度良好，實驗誤差較小。R2=0.991 2表明響應值酶活大小實際值與預測值之間具有較好的擬合度，該試驗方案是可行的，C.V.=2.45%進一步說明，回歸模型也能較好的反應真實實驗值。以顯著水平（P＜0.05）為基礎條件，基于回歸方程的因素顯著性分析，影響木瓜蛋白酶酶活的回歸模型中的一次項（A、B、C），二次項（A2、B2、C2、D2），交互項AC均表現(xiàn)顯著，由F值可得，影響酶活力大小的條件的順序為：C（溫度）＞A（壓力）＞B（時間）＞D（物料濃度）。綜合分析比較得出，響應面分析能較好地預測超濾法提取木瓜蛋白酶的酶活性大小。

通過Design Expert 7.0軟件對響應面優(yōu)化工藝結(jié)果分析得到超濾法提取木瓜蛋白酶的最有條件為：壓力0.25 MPa，時間3.71 min，溫度55.8℃，物料濃度31%時。理論上木瓜蛋白酶的最大活性可達到9.355萬單位/mg。為驗證響應面法所得預測值的準確性，綜合考慮試驗中實際操作的客觀性，將最佳的條件修正為壓力0.25 MPa，時間3.7 min，溫度55℃，物料濃度30%，根據(jù)修正后的條件，做3次平行試驗驗證測得的酶活性大小為（9.31±0.27）萬單位/mg，證明了響應面優(yōu)化超濾法提取木瓜蛋白酶的準確性和有效性，表明建立并優(yōu)化模型的可靠性。

3結(jié)論

通過比較不同濃度的酶保護劑對提取木瓜蛋白酶活性大小的影響，結(jié)果顯示L-cys、EDTA濃度分別為0.04、0.002 mol/L時木瓜蛋白酶提取效果更好。在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對該酶提取過程中的主要影響因子進行優(yōu)化，建立了較合理有效的酶活與溫度、壓力、時間、物料濃度的數(shù)學模型，該模型能較好的測算提取出來的木瓜蛋白酶的酶活性大小。

應用響應面法優(yōu)化得到的木瓜蛋白酶提取最佳條件為：壓力0.25 MPa，時間3.7 min，溫度55℃，物料濃度30%，此時酶活性大小為（9.31±0.27）萬單位/mg，與模型驗證的酶活性9.355萬單位/mg非常接近。說明響應面法能較好的用于木瓜蛋白酶提取工藝的優(yōu)化，為木瓜蛋白酶提取產(chǎn)量的提高奠定基礎。

［1］Azarkan M，Moussaoui A E，Wuytswinkel D V，et al.Ractionation and purification of the enzymes stored in the latex of Carica papaya［J］.Journal of Chromatography B，2003，790（1/2）：229-238

［2］SUMNER IG.Factors affecting the thermostability of cysteine proteinases from Carica papaya［J］.European Journal of Bio-chemistry，1993，214（1）：129-134

［3］熊華.木瓜蛋白酶的應用研究進展［J］.四川食品與發(fā)酵，2005（4）：9-10

［4］王晟，崔潔，顧欣，等.木瓜蛋白酶制備山杏源降糖肽工藝優(yōu)化研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（9）：169-173

［5］Huang X L，Catignani G L，Swaisgood H E.Comparison of the properties of trypsin immobilized on 2 CeliteTM derivatives［J］.Journal of Biotechnology，1997，53（1）：21-27

［6］Feller G，Narinx E，Aprigny J L，et al.Enzymes from psychrophilic organisms［J］.FEMS Microbiology Reviews，1996，18（2/3）：189-202

［7］吳建中，趙謀明，寧正祥，等.木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白研究［J］.大豆科學，2002，8（21）：187-190

［8］巫慶華.木瓜蛋白酶凝固大豆蛋白機理［J］.乳業(yè)科學與技術，2002（1）：6-9

［9］劉登勇.食品添加劑在肉類嫩化中的作用［J］.肉類工業(yè)，2003（3）：26-30

［10］解蕊，張根生，范俊杰，等.木瓜蛋白酶水解雞骨泥工藝條件的研究［J］.食品工業(yè)，2002（1）：40-42

［11］Tucker G A，Woods L F G.酶在食品加工中的應用［M］.2版.北京：中國輕工業(yè)出版社，2002：127-133

［12］宋常欣，陳玲.啤酒非生物穩(wěn)定劑的應用和比較［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，3（27）：79-81

［13］乙引，陳平，王茜，等.木瓜蛋白酶改良啤酒品質(zhì)的研究［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學，2000，28（4）：14-16

［14］鄧靜，吳華昌，周健.木瓜蛋白酶研究進展［J］.廣西輕工業(yè)，2003（3）：5-7

［15］牟利輝.木瓜蛋白酶的應用研究［J］.廣東化工，2008，35（10）：96-98

［16］涂紹勇，李路，楊愛華，等.雙相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，19（9）：220-222

［17］劉葉青，周勤.用絮凝和超濾技術純化木瓜蛋白酶［J］.華東理工大學學報，1996，22（1）：43-46

［18］任國梅，陳孜.高質(zhì)量木瓜蛋白酶純化工藝研制探討［J］.藥物生物技術，1997，4（4）：232-235

［19］D’Souza F，Lali A.Purification of papain by immobilized metal affinity chromatography（IMAC）on chelating carboxymethyl cellulose［J］.Biotechnology Techniques，1999，13（1）：59-63

［20］Nitsawang S，Hatti-Kaul R，Kanasawnd P.Putification of papain from Carica papaya latex：Aqueous two-phase extraction versus twosteps salt precipitation［J］.Enzyme and Microbial Technology，2006，39（5）：1103-1107

［21］萬婧，張海德，曹貴蘭.超濾法在番木瓜提取木瓜蛋白酶工藝中的應用研究［J］.糧食與食品工業(yè)，2012，4（19）：33-37

［22］陳德梅，符秀娟.木瓜酶酶活力測定方法在實際生產(chǎn)中的適用性［J］.廣東藥學院學報，2003，20（3）：244-245

Response Surface Method Optimization Papain Extraction Process

WANG Tian-lin，LIANG Xin-hong，SUN Jun-liang*，MO Hai-zhen，ZHOU Meng
（College of Food，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan，China）

Using fresh papaya as raw material.Extraction of papain on ultrafiltration choicing the L-cys，EDTA，pressure，temperature，time，solid-liquid ratio，six factors as single factor experiment，the extraction of papain by ultrafiltration to determine the optimum process conditions，the L-cys and EDTA for the enzyme protective agent optimal concentrations were：0.04 mol/L and 0.002 mol/L.The selected temperature，pressure，time and ratio of material to liquid four conditions by response surface experiments，mathematical model，and regression analysis，evaluation model，the results showed that the optimum conditions of ultrafiltration extraction of Papain is：temperature 55℃，pressure 0.25 MPa，time 3.7 min，material density 30%，the enzyme activity is（9.31±0.27）（U×10 000）/mg，it is close with the model validation activity of 9.355（U×10 000）/mg. That response surface method can be used to optimize the extraction process of papain better.

papain；ultrafiltration；responsesurfacemethodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.021

2015-11-22

河南省科技計劃項目（142102110127）；河南省教育廳自然科學研究資助計劃項目（14A550010）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃項目（16IRTSTHN007）

王田林（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

孫俊良（1964—），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術。