XAV939對卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及Wnt/β-catenin信號的抑制作用

汪彩霞,陳　說,趙　楊

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XAV939對卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及Wnt/β-catenin信號的抑制作用

汪彩霞1,陳說2,趙楊2

目的探討XAV939對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移方面的影響及其對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制作用。方法采用MTT法檢測XAV939對卵巢癌細(xì)胞活力的抑制作用，劃痕實(shí)驗(yàn)觀察XAV939對細(xì)胞遷移能力的影響，Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測XAV939對卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，Westernblot方法檢測wnt1、β-catenin、TCF4蛋白以及基質(zhì)金屬硫蛋白9(Metallothioneinmatrixprotein，MMP9)的表達(dá)水平。結(jié)果XAV939作用48h后，抑制率明顯上升,尤其濃度達(dá)到8μmol/L(31%±1%,P=0.034)、16μmol/L(51%±4%,P=0.028)，且劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示XAV939能抑制卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，westernblot結(jié)果顯示，wnt1、β-catenin、TCF4、MMP9的表達(dá)水平均有所降低。結(jié)論XAV939通過Wnt/β-catenin信號通路來抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

卵巢癌;XAV939;Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路; 侵襲遷移

近年來，卵巢癌是危及女性健康的惡性腫瘤，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第2位[1]。盡管手術(shù)切除和化學(xué)療法取得了一定的療效，但是卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移成為患者高病死率居高不下的根源。卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是多基因多因素作用的過程。臨床試驗(yàn)表明，卵巢癌的發(fā)生與基因突變和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)有著密切的關(guān)系。越來越多的證據(jù)顯示，wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系緊密。因此，針對β-catenin基因的靶向治療已經(jīng)成為這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。XAV939是Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制藥[2]，在肝癌[3]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[4]等癌癥中研究甚多。在胃癌研究[5]中認(rèn)為，它可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但是在卵巢癌的研究中比較少見。本實(shí)驗(yàn)采用XAV939作用于卵巢癌細(xì)胞，探究其對卵巢癌侵襲遷移的影響，從而為臨床卵巢癌的治療提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3購自ATCC細(xì)胞庫(美國)。XAV939購自上?；菡\生物科技有限公司，MTT購自Amresco，Transwell培養(yǎng)板購自BD公司(美國)，RPMI1640購自Hyclone公司。β-catenin和Wnt1購自Santacruzbiotechnology，MMP9和TCF4購自Proteintech。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)OVCAR3細(xì)胞用含10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置37 ℃恒溫、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。1～2d換液傳代1次，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法測定IC50收集對數(shù)期細(xì)胞，以3×103個(gè)/孔接種于96孔板，置于5%CO2,37 ℃孵箱中孵育過夜，加入不同濃度(0、0.125、0、25、0.5、1、2、4、8、16、32μmol/L)XAV939，同時(shí)設(shè)1個(gè)對照組(DMSO)和1個(gè)空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h。然后，每孔加入20μl0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO，于490nm波長處測定吸光度值。

1.2.3劃痕試驗(yàn)取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，大約5×105/(ml·孔)。待細(xì)胞單層鋪滿培養(yǎng)基時(shí)，用200μl的Tip頭進(jìn)行劃痕。用PBS清洗細(xì)胞2～3次，去除細(xì)胞碎片。并在實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的XAV939。置于37 ℃，5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在0、48h取樣拍照。

1.2.4Transwell試驗(yàn)在已鋪好膠Transwll的下室加入500μl含10%的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，上室加入200μL無血清的細(xì)胞懸浮液(2.5×105個(gè)/ml)及不同濃度梯度的XAV939，并放置在37 ℃，5%CO2進(jìn)行孵育24h。然后，用4%多聚甲醛溶液固定20min，PBS清洗后用0.1%結(jié)晶紫染色，于Olympus倒置熒光顯微鏡下觀察計(jì)算穿過Matrigel聚合膠及小室微孔膜的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5Westernblot檢測蛋白表達(dá)水平于處理后的細(xì)胞加入裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行定量分析。配膠、上樣(樣品加入2×SDS加樣緩沖液)并進(jìn)行SDS—PAGE凝膠電泳分離蛋白。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4 ℃封閉過夜。一抗室溫孵育2h，棄掉一抗，加入二抗，于室溫平緩搖動(dòng)2h。每次孵育后均用TBST洗薄膜3次。采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測相關(guān)蛋白。等比例混合發(fā)光劑和增強(qiáng)劑，反應(yīng) 5min。放入暗盒進(jìn)行X線顯影，觀察結(jié)果。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，兩樣本之間進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本之間進(jìn)行方差分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1MTT實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示，以DMSO組為對

照，XAV939作用48h后對卵巢癌細(xì)胞的抑制率呈濃度依賴性，其抑制率分別為2μmol/L(17%±0.4%)、4μmol/L(19%±1%)、8μmol/L(31%±1%)、16μmol/L(51%±4%)、32μmol/L(55%±2%)，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)XAV939的干預(yù)濃度為2、4、8和16μmol/L。見圖1。

圖1　不同濃度的XAV939作用48 h后對OVCAR3細(xì)胞活力的影響①P<0.05

2.2劃痕試驗(yàn)和Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，卵巢癌細(xì)胞OVCAR3經(jīng)過4、8、16μMXAV939處理48h后細(xì)胞遷移能力顯著降低，呈現(xiàn)劑量依賴性。遷移率由DMSO組(0.31±0.02)降低至4μM(0.2±0.04)、8μM(0.16±0.02)、16μM(0.09±0.04)，均P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)，穿過小室的癌細(xì)胞數(shù)目DMSO組(773±35)明顯高于4μmol/L(620±49)、8μmol/L(436±17)、16μmol/L(322±13)，均P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且隨著濃度的增加，穿過小室的細(xì)胞更少。

2.3Westernblot檢測β-catenin、wnt1、TCF4、MMP9表達(dá)水平的變化Westernblot實(shí)驗(yàn)(圖4)表明，wnt信號通路的蛋白wnt1、β-catenin、TCF4、MMP9的表達(dá)水平均有所降低，且這些變化都呈濃度依賴性。

圖2　XAV939對OVCAR3細(xì)胞的影響

圖3　XAV939對OVCAR3細(xì)胞侵襲能力的影響細(xì)胞侵襲(放大倍數(shù)×20)能力明顯下降。①P<0.05。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次

圖4　XAV939對TCF4、β-catenin、wnt-1

3　討　　論

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力是腫瘤惡變的標(biāo)志。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。Jang等[6]通過靶向敲除wnt1，發(fā)現(xiàn)乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯受到抑制。同樣在卵巢癌上皮細(xì)胞癌的研究中，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示β-catenin在卵巢癌組織的的表達(dá)大于正常組織，這些結(jié)果提示wnt/β-catenin在卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移起著重要的作用[7]。筆者采用wnt/β-catenin信號通路的特異性抑制劑XAV939來處理卵巢癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)XAV939能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并且呈劑量依賴性。筆者發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用XAV939處理卵巢癌細(xì)胞后，wnt1，β-catenin表達(dá)下降，TCF4與MMP9的表達(dá)也下降。

β-catenin以結(jié)合型和游離型存在于細(xì)胞中，前者通過與上皮鈣黏蛋白E-cadherin結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附；后者通過wnt信號通路，作用于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF，來參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[7]。wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活機(jī)制是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過程。大量的實(shí)驗(yàn)研究得出，在wnt蛋白缺失的情況下，胞內(nèi)的β-catenin被磷酸化進(jìn)而由蛋白酶降解，因此在胞內(nèi)保持著較低水平。當(dāng)wnt蛋白存在的情況下，β-catenin低磷酸化水平導(dǎo)致胞內(nèi)的β-catenin的累積，隨之進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過與LEF/TCF形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[8，9]。作為wnt信號通路的分子開關(guān)，TCF家族對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移抑制起著重要作用，尤其是TCF4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。

Sanchez-TilloE[11]等發(fā)現(xiàn)，β-catenin/TCF4通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑來介導(dǎo)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

此外，細(xì)胞外基質(zhì)ECM降解在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移也起著重要作用。越來越多的實(shí)驗(yàn)證明，基質(zhì)金屬硫蛋白MMPs的異常與腫瘤的轉(zhuǎn)移密不可分，如胃癌[12]、肝細(xì)胞癌[13]。王紅民等[14]通過對肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，MMP9在低分化的肺癌中高水平表達(dá)。體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明，低水平的MMP9能增強(qiáng)細(xì)胞間的附著能力，從而抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移，這可能與MMP能降解ECM的作用有關(guān)[15，16]。多項(xiàng)研究顯示，wnt信號通路通過核內(nèi)β-catenin來激活MMPs，進(jìn)而介導(dǎo)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[17，18]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，XAV939不僅抑制wnt/β-catenin信號通路，并且還可以通過抑制其下游的基因TCF4及MMP9來抑制卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。通過本研究，筆者首次提出XAV939通過wnt/β-catenin信號通路來抑制卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，并為卵巢癌的治療策略開拓了新思路。

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(2015-10-14收稿2015-12-20修回)

(責(zé)任編輯梁秋野)

AStudyonXAV939’sfunctionininhibitingovariancancercellsmigrationandinvasion

WANGCaixia1,CHENShuo2,andZHAOYang2.

1.ChinaMedicalUniversity，Shenyang110013,China; 2.GynecologyDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China

ObjectiveToinvestigatetheeffectsofXAV939oninvasionandmetastasisofovariancancercellsaswellastheinhibitionoftheWnt/β-cateninsignalingpathway.MethodsTheMTTassaywasusedtodetecttheinhibitioneffectofXAV939ontheviabilityofovariancancer,theinhibitionofcellmetastasiswasdetectedbyscratchtestandtranswellcellmigrationassay,theexpressionlevelofβ-catenin,wnt1,TCF4andMMP9proteinbyWesternblotting.ResultsTheMTTassayshowedthattheinhibitionrateofovariancancerincreasedsignificantlybyXAV939for48h,especiallytheconcentrationof8μmol/L(31%±1%,P=0.034),16μmol/L(51%±4%,P=0.028).ScratchtestandtranswellcellmigrationassayshowedtheinhibitionofinvasionandmetastasisafterXAV939treatment.Inaddition,theresultsofWesternblottingshowedthatXAV939reducedtheexpressionofwnt1,β-catenin,TCF4,andMMP9protein.ConclusionXAV939caninhibittheinvasionandmigrationofovariancancercellsthroughWnt/β-cateninpathway.

ovariancancer;XAV939;wnt/β-cateninsignalingpathway;invasionandmetastasis

國家自然基金項(xiàng)目(81202049, 81472440)

汪彩霞，碩士。

1.110013沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)七年制(實(shí)驗(yàn)班)；2.110001沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科

趙楊，E-mail:yida.zhaoyang@163.com

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