Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

朱智杰，阮君山，李 堯，陸 茵，2，鄭仕中，2，王愛云，2，陳文星，2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210029;2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210046)

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移能力的過程［1］。在EMT過程中，細(xì)胞會(huì)失去極性、與周圍細(xì)胞和基質(zhì)的接觸減少，細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞表型發(fā)生改變，出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的特性。EMT是胚胎早期發(fā)育和器官生成中的一個(gè)極其重要的過程，同時(shí)傷口愈合以及許多惡性上皮腫瘤發(fā)展的過程也與EMT密切相關(guān)［2－3］。誘導(dǎo)EMT發(fā)生的信號(hào)通路中，Wnt信號(hào)通路是誘導(dǎo)上皮組織EMT產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

Wnt信號(hào)具有重要的生理功能，在早期的胚胎生長發(fā)育過程中，Wnt信號(hào)通路是腦和神經(jīng)系統(tǒng)形成的必要因素［4－5］。同時(shí)，Wnt信號(hào)與干細(xì)胞自我更新和分化調(diào)控也密切相關(guān)，Wnt信號(hào)通路對(duì)于造血干細(xì)胞的自我更新有著重要意義，還維持小腸組織的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)骨密度以及脂肪細(xì)胞的分化［6］。然而，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的失調(diào)與多種已知的高發(fā)性癌變有關(guān)［7］。根據(jù)Wnt蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的方式不同，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路(canonical Wnt signaling pathway)和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路(noncanonical Wnt signaling pathway)。如 Fig 1所示，經(jīng)典 Wnt通路(Wnt/βcatenin通路)通過核內(nèi)β鏈接蛋白(β-catenin)的累積，激活Wnt相關(guān)靶基因，這條通路中的成分(β-catenin，Axin)活化過度或者失調(diào)可引起腫瘤的形成;非經(jīng)典通路又主要分為兩條:(1)Wnt/Ca2+通路由Wnt5A和Wnt11激活，通過鈣調(diào)蛋白依賴的激酶Ⅱ(CamkⅡ)、鈣調(diào)蛋白敏感的蛋白磷酸酶(Calcn)和T細(xì)胞核因子NF-AT的作用，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加并激活蛋白激酶C(PKC)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞之間的黏附。(2)細(xì)胞平面極性通路(Wnt/polarity通路)，又稱Wnt/PCP途徑或Wnt/Jun激酶途徑，涉及RhoA和Jun激酶(JNK)，此通路主要調(diào)控腫瘤細(xì)胞骨架的重排，控制細(xì)胞骨架的形成，參與腫瘤細(xì)胞的變形、遷移以及腫瘤細(xì)胞的極性變化等［8］。近幾年國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt的經(jīng)典和非經(jīng)典通路均參與EMT的誘導(dǎo)過程，不同Wnt信號(hào)通路之間以及Wnt信號(hào)與其他通路間有時(shí)還存在相互作用(cross talk)，這使其分子機(jī)制變得異常復(fù)雜。但Wnt信號(hào)通路是EMT最主要的誘因之一，本文著重論述近幾年關(guān)于Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤EMT過程的重要進(jìn)展，期望能對(duì)腫瘤研究的科學(xué)工作者提供借鑒。

1 Wnt/β-catenin通路在腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

Wnt經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)節(jié)由胞質(zhì)β-鏈接蛋白的磷酸化/降解引起。如Fig 1所示，在沒有Wnt信號(hào)時(shí)，大部分β-鏈接蛋白與E鈣黏附蛋白(E-cadherin)和細(xì)胞骨架蛋白(actin)結(jié)合維持其穩(wěn)定性，少部分與大腸腺瘤樣蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、GSK3β及軸蛋白(axin)結(jié)合形成“降解復(fù)合物”，隨后進(jìn)行泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解，使胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin維持在低水平，不能進(jìn)入核內(nèi)激活作用靶點(diǎn)。在有 Wnt信號(hào)存在時(shí)，形成 Wnt蛋白、Frizzled和LRP5/6的復(fù)合物，信號(hào)通過作用于胞質(zhì)內(nèi)蓬松蛋白(Dvl)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的降解復(fù)合物失去活性，并發(fā)生解離，使之不能再磷酸化β-catenin，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)的水平得到累積，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，在胞核與T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子(LEF)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［9］。

β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核并堆積在核內(nèi)，與腫瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生以及腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Prasad等［10］研究發(fā)現(xiàn)，波形蛋白表達(dá)與細(xì)胞核β-catenin以及胞質(zhì)內(nèi)蓬松蛋白(Dvl)之間有明顯的關(guān)聯(lián)，證明了在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌(IDCs)中Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo) EMT發(fā)生的重要性。Prasad等［11］又進(jìn)一步通過對(duì)98例臨床浸潤性乳腺導(dǎo)管癌樣本中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)方式以及關(guān)鍵組分E鈣粘素、Slug和GSK3β之間關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)，Slug作為介導(dǎo)EMT發(fā)生的重要分子，可以通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路降低E鈣粘素，首次提供了臨床證據(jù)支持在浸潤性乳腺導(dǎo)管癌的EMT中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)上調(diào)。Zhao等［12］研究發(fā)現(xiàn)，使用缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞(LNCaP)發(fā)生EMT。細(xì)胞的間質(zhì)標(biāo)志物呈現(xiàn)高表達(dá)，上皮標(biāo)記物則低表達(dá);而轉(zhuǎn)染β-catenin的短發(fā)卡RNA(shRNA)后，細(xì)胞上皮標(biāo)記物E鈣粘素表達(dá)增加，間質(zhì)標(biāo)記物N-鈣粘素(N-cadherin)，波形蛋白(vimentin)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達(dá)則明顯下降，通過β-catenin的shRNA作用，LNCaP細(xì)胞的EMT發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，證明了Wnt/β-catenin信號(hào)通路作為一個(gè)必要的內(nèi)源性信號(hào)，可能直接控制HIF-1α 誘導(dǎo) EMT 的發(fā)生。Stemmer等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)激活可以使Slug、Snail、Twist等表達(dá)增加，降低E鈣粘素并形成EMT。而在結(jié)腸癌細(xì)胞系的EMT過程中，Snail過表達(dá)可以增加Wnt信號(hào)靶基因的表達(dá)，Snail通過其N端與β-catenin相互作用，進(jìn)一步激活Wnt信號(hào)下游靶基因的表達(dá)，從而形成Wnt信號(hào)激活的正反饋。

Fig 1 Wnt signaling pathway

2 非經(jīng)典Wnt通路在腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種Wnt蛋白，其并不通過β-catenin在核內(nèi)積累而產(chǎn)生Wnt信號(hào)，包括Wnt5A、Wnt11在內(nèi)的多種Wnt蛋白是通過非經(jīng)典Wnt信號(hào)發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)。深入的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt非經(jīng)典信號(hào)通路也參與腫瘤細(xì)胞EMT的誘導(dǎo)過程。

Dissanayake等［14］通過對(duì)黑色素瘤 EMT的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5A可以增加Snail以及波形蛋白，減少E鈣粘素的表達(dá)。使用蛋白激酶C(PKC)抑制劑后加入人重組Wnt5A與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，可以明顯抑制Snail的表達(dá)，提示W(wǎng)nt5A是通過PKC途徑誘導(dǎo)黑色素瘤EMT和轉(zhuǎn)移的。Fort等［15］對(duì)神經(jīng)嵴(NC)細(xì)胞中 Rho家族研究發(fā)現(xiàn)，Wnt的應(yīng)答基因RhoU/wrch1在顱神經(jīng)嵴細(xì)胞(CNC)中表達(dá)，RhoU通過激活JNK調(diào)控Wnt/polarity通路發(fā)生作用，細(xì)胞中的RhoU的表達(dá)水平在EMT形成以及腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色。體外研究還發(fā)現(xiàn)，RhoU與PAK1和Rac1共同在EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起作用［16］。Chen等［17］對(duì)小獵犬腎上皮細(xì)胞中EMT的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中Wnt5A的表達(dá)增加，使用siRNA沉默Wnt5A后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移能力明顯下降。在EMT過程中還發(fā)現(xiàn)RhoA，Rac以及JNK等調(diào)控因子的表達(dá)都上調(diào)，說明Wnt5A還可以通過細(xì)胞平面極性通路誘導(dǎo)EMT的產(chǎn)生。

3 經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路共同作用

在某些情況下，一種Wnt蛋白的下游信號(hào)可以是經(jīng)典Wnt信號(hào)，也可以是非經(jīng)典Wnt信號(hào)，所以有些EMT的產(chǎn)生是通過Wnt的經(jīng)典和非經(jīng)典通路共同誘導(dǎo)的。

von Gise等［18］對(duì)腎母細(xì)胞腫瘤基因(WT1)的研究發(fā)現(xiàn)，WT1可以調(diào)控心外膜上的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，通過使用遺傳譜系跟蹤法獲得缺少WTI基因［WT1(KO)］的心外包膜和心外包膜衍生物。研究發(fā)現(xiàn)，WT1(KO)不會(huì)發(fā)生EMT，一方面WT1(KO)的心外包膜上Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要成分Lef1和Ctnnb1(β-catenin)表達(dá)下降，該通路下游的Axin2、Cyclin D1和Cyclin D2的活性也降低;另一方面，WT1(KO)與具有WT1的心外膜相比，Wnt5A和Raldh2表達(dá)明顯下降，說明WT1可以通過經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt通路共同調(diào)控心外膜的 EMT。Iwai等［19］發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌(SCC)胞質(zhì)中堆積大量β-catenin，不但增加Tcf/Lef介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，還上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)的靶基因MMP-7，并且增加Rho家族Cdc42和Rac的水平，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提高口腔鱗狀癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Chung等［20］報(bào)道，分泌型卷曲相關(guān)蛋白SFRP1和SFRP2在宮頸癌CaSki細(xì)胞中能引起Wnt信號(hào)的衰減，降低β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的異常堆積，抑制癌細(xì)胞的生長，同時(shí)還能增加E鈣粘素并降低Slug、Twist和Snail的表達(dá)。而β-catenin在CaSki或者HeLa3rd細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)出不同的堆積狀態(tài)，提示SFRP1和SFRP2通過不同的Wnt信號(hào)產(chǎn)生作用。

Tab 1 信號(hào)通路在不同腫瘤中的分布

4 Wnt信號(hào)通路與其他信號(hào)通路的相互作用

Wnt信號(hào)通路作為誘導(dǎo)腫瘤EMT的重要信號(hào)，還與TGF-β、PI3K/Akt、Notch等其他信號(hào)通路有著一定程度的相互作用(cross talk)。通過對(duì)Wnt信號(hào)通路與其他信號(hào)的相互作用的研究，可以進(jìn)一步了解EMT的機(jī)制的復(fù)雜性，同時(shí)也為如何逆轉(zhuǎn)EMT提供了思路。

4.1Wnt與TGF-β信號(hào)通路Scheel等［21］最新研究證實(shí)在永久化人乳腺上皮細(xì)胞(HMLE)中，經(jīng)典及非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與TGF-β協(xié)同作用誘導(dǎo)激活細(xì)胞EMT程序，之后以自分泌的方式維持最終的間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)，證實(shí)在上皮細(xì)胞中下調(diào)內(nèi)源的自分泌信號(hào)抑制因子可誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)EMT程序。反之，當(dāng)在細(xì)胞中添加相關(guān)信號(hào)通路抑制劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)自分泌信號(hào)破壞可導(dǎo)致原代永久化人乳腺上皮細(xì)胞遷移及自我更新受到抑制，并降低了轉(zhuǎn)化衍生物誘導(dǎo)的腫瘤形成及轉(zhuǎn)移。Qin等［22］在卵巢上皮細(xì)胞中，通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)Wnt通路下游的LEF1可作為TGF-β通路中Smad蛋白的共調(diào)節(jié)因子，共同參與對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，從而連接Wnt和TGF-β/Smad兩條信號(hào)通路。

4.2Wnt與PI3K/Akt通信號(hào)通路Wnt與 PI3K/Akt信號(hào)通路在EMT過程中對(duì)GSK3磷酸化的不同作用，同時(shí)通過刺激Wnt/Disheveled信號(hào)可以進(jìn)一步激活A(yù)kt的活性，并且Akt可能作用于β-catenin的轉(zhuǎn)錄以及磷酸化過程，然而兩個(gè)信號(hào)通路在EMT過程的直接相互作用則有待進(jìn)一步的研究［23］。

4.3Wnt與Notch信號(hào)通路許多文獻(xiàn)都報(bào)道了Wnt和Notch通路的交聯(lián)，Niessen等［24］報(bào)道在上皮細(xì)胞中，Snail2是Notch信號(hào)通路的一個(gè)靶基因，而Notch信號(hào)則可以直接上調(diào) Slug，促進(jìn) EMT的形成。Devgan等［25］的研究揭示Notch信號(hào)對(duì)皮膚角質(zhì)細(xì)胞β-catenin有調(diào)節(jié)作用，Notch通路能夠上調(diào)p21基因的表達(dá)，而p21蛋白可以與轉(zhuǎn)錄因子E2F-1共同作用于Wnt4基因的啟動(dòng)子，下調(diào)Wnt4蛋白的表達(dá)。

4.4Wnt與Hedgehog信號(hào)通路研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號(hào)可以上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞中SFRP1、SNAI1(Snail)以及ZEB1和ZEB2的水平［26］。Yang等［27］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠基底細(xì)胞癌(BCC)的上皮芽和錯(cuò)構(gòu)瘤中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)癌基因M2SMO表達(dá)，進(jìn)一步激活Hedgehog信號(hào)。

5 基于Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT的抗腫瘤藥物

由于EMT在腫瘤的發(fā)展過程中扮演重要角色，阻斷甚至逆轉(zhuǎn)EMT可為腫瘤的的治療提供新的思路，通過藥物調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，可能成為抗腫瘤的新方法，同時(shí)對(duì)抗腫瘤藥物的發(fā)展具有積極的推動(dòng)作用。

閆喆等［28］研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦可以下調(diào) Wnt4、α-SMA及β-catenin核蛋白表達(dá)，升高E鈣粘素的表達(dá)水平，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)途徑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT。趙士彭等［29］報(bào)道塞來昔布通過COX-2依賴或非依賴途徑抑制Wnt信號(hào)通路從而抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長，誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡。黃偉平等［30］發(fā)現(xiàn)舒林酸通過下調(diào) β-catenin抑制肝癌細(xì)胞的Wnt信號(hào)通路，下調(diào) cyclinD1的表達(dá)。馬駿飛等［31］研究發(fā)現(xiàn)布洛芬可以使肝癌細(xì)胞HepG2在細(xì)胞核中β-catenin堆積減少，胞質(zhì)中增多，通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，影響β-catenin的表達(dá)和定位，調(diào)節(jié)下游相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

6 結(jié)語

上皮細(xì)胞發(fā)生EMT獲得間質(zhì)細(xì)胞特性從而使腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)展過程中扮演了重要的角色，而Wnt信號(hào)則是誘導(dǎo) EMT發(fā)生的重要途徑之一。EMT并非永久的，在一定的條件下可以發(fā)生阻斷甚至逆轉(zhuǎn)，通過對(duì)Wnt信號(hào)誘導(dǎo)EMT過程的研究，對(duì)我們進(jìn)一步揭示腫瘤的本質(zhì)，尋找臨床有效治療手段提供了新思路。同時(shí)，EMT的發(fā)生以及Wnt信號(hào)通路中的信號(hào)分子表達(dá)異常還可以作為早期腫瘤診斷的標(biāo)記，讓我們能夠盡早及時(shí)的趨利避害。而且不同的Wnt信號(hào)在不同的腫瘤細(xì)胞中可能存在特殊的分布(如表1)，可能與不同的腫瘤微環(huán)境有關(guān)。對(duì)Wnt信號(hào)與其他信號(hào)在EMT過程中的相互作用研究讓我們更加全面了解EMT復(fù)雜性的同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有些信號(hào)分子可以作為靶點(diǎn)來調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)。因此，了解Wnt信號(hào)通路對(duì)EMT的誘導(dǎo)過程，對(duì)于如何有效阻斷或逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生以及腫瘤的診斷和治療都有著重要意義。

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