氟西汀調(diào)控CUMS抑郁大鼠海馬突觸重塑*

沈忠飛， 王志堅(jiān)， 潘巍巍， 郭燕君， 伏春艷， 袁鳳鳳

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 嘉興 314000)

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氟西汀調(diào)控CUMS抑郁大鼠海馬突觸重塑*

沈忠飛△， 王志堅(jiān)， 潘巍巍， 郭燕君， 伏春艷， 袁鳳鳳

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 浙江 嘉興 314000)

目的： 探究氟西汀(fluoxetine)對慢性不可預(yù)見性溫和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)抑郁大鼠海馬突觸重塑的mTOR和細(xì)胞自噬信號調(diào)控作用。方法: 60只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分成正常對照(control)組、CUMS組和氟西汀組。采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)法構(gòu)建CUMS抑郁模型，期間給予氟西汀(20 mg·kg-1·d-1)灌胃治療。通過體重變化、糖水測試水平及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型建立，采用RT-PCR和Western blotting等生化方法測定突觸重塑相關(guān)蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、突觸泡蛋白(synaptophysin, SYP)，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、cleaved caspase-3，mTOR信號通路相關(guān)蛋白mTOR、4EBP1，自噬相關(guān)蛋白beclin 1、LC3 mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果: 與control組相比，CUMS大鼠的體重、糖水?dāng)z取量、曠場實(shí)驗(yàn)總路程和中間停留時(shí)間均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。RT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組相比，CUMS組SYP和GFAP的mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)， cleaved caspases-3上調(diào)，mTOR及下游靶分子4EBP1磷酸化水平下調(diào)，細(xì)胞自噬關(guān)鍵基因beclin1和LC3 在mRNA和蛋白水平顯著上調(diào)。氟西汀可以減緩以上結(jié)果中的上調(diào)或下調(diào)趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)論: 氟西汀可能通過下調(diào)細(xì)胞凋亡和自噬信號通路以及上調(diào)mTOR信號通路調(diào)節(jié)海馬突觸重塑并緩解抑郁癥狀。

氟西汀； 抑郁； 突觸重塑； 細(xì)胞凋亡； mTOR信號通路； 自噬

抑郁癥是以情緒低落、快感缺失、疲憊和認(rèn)知功能下降為主要特征的一類精神疾病，患者還常常伴隨失眠、腸胃紊亂和自責(zé)感，嚴(yán)重可產(chǎn)生自殺傾向[1]。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，中國每年有20萬人死于抑郁癥，世界衛(wèi)生組織預(yù)測抑郁癥在 2020 年左右將成為繼高血壓之后的第二大臨床慢性疾病[2]。由于抑郁癥常與酒精成癮等其它生活惡習(xí)存在相關(guān)，或存在共病機(jī)制，復(fù)雜多樣，目前發(fā)病機(jī)制并沒有定論[3]。對抑郁癥患者腦部進(jìn)行核磁共振成像顯示，抑郁癥患者海馬體積明顯小于正常人[4]，突觸重塑對于海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的維持與改變有著密切關(guān)聯(lián)，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑郁發(fā)生時(shí)伴隨較高的細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對患者尸檢結(jié)果顯示抑郁發(fā)生后mTOR磷酸化水平降低，并且細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白beclin 1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)表達(dá)升高[5]，提示細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬可能參與抑郁的發(fā)生發(fā)展，并且靶向細(xì)胞自噬和mTOR信號通路有可能是治療甚至是預(yù)防抑郁的新思路。目前，關(guān)于SSRI類藥物氟西汀(fluoxetine)治療抑郁癥的機(jī)制，大家無爭議地認(rèn)為氟西汀是通過抑制5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體、增加突觸間隙中5-HT的含量來發(fā)揮作用的[6]。但是關(guān)于氟西汀治療抑郁的具體的信號通路，尤其是結(jié)合突觸重塑與mTOR和細(xì)胞自噬信號通路關(guān)系的研究幾乎未見涉及。本實(shí)驗(yàn)以慢性不可預(yù)見性溫和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法建立大鼠抑郁模型，采用Western blotting和逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)等分子生物學(xué)方法檢測氟西汀干預(yù)治療后大鼠海馬突觸重塑和相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的變化，以探討氟西汀對抑郁發(fā)生的信號通路調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體重190 g～210 g。

1.2 試劑和儀器 兔抗beclin 1和LC3抗體(Abcam)；兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和 突觸泡蛋白(synaptophysin,SYP)抗體(武漢博士德生物公司)；兔抗Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、mTOR、p-mTOR、 4EBP1、p-4EBP1、β-actin和山羊抗兔 II 抗(CST)；氟西汀(禮來蘇州制藥有限公司)。動物行為自動跟蹤分析系統(tǒng)(Ethovision 3.0，Noldus)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(12 h光照、12 h黑暗，黑暗時(shí)間20:00～8:00)，期間大鼠自由進(jìn)食飲水。將大鼠隨機(jī)分為3組(每組20只)：對照(control)組、CUMS組和fluoxetine組。

2.2 給藥方法 在CUMS刺激2周后給予氟西汀組灌胃氟西汀2周，每次給藥前將氟西汀溶于生理鹽水，給藥時(shí)間為每天9:00～11:00。氟西汀按照20 mg/kg[7]進(jìn)行灌胃，對照組及CUMS組在相同時(shí)間灌胃等體積的生理鹽水。

2.3 CUMS抑郁模型的建立 聯(lián)合應(yīng)用CUMS和孤養(yǎng)法建立抑郁模型。刺激包括鼠籠45 度傾斜2 h，黑白顛倒，行為限制2 h，禁食24 h，夾尾1 min，潮濕墊料24 h，禁水24 h，4 ℃冰水游泳5 min，懸尾20 min。上述9種應(yīng)激隨機(jī)安排，每天1種刺激，持續(xù)28 d，同一刺激不連續(xù)出現(xiàn)，使大鼠無法預(yù)見刺激。

2.4 動物行為學(xué)評定 給藥完畢完成3組大鼠的行為學(xué)測定。 (1)糖水偏好實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前動物已進(jìn)行糖水適應(yīng)性訓(xùn)練。禁水12 h后(20:00～8:00)，在8:00～9:00進(jìn)行糖水實(shí)驗(yàn)。給予動物事先稱量好的2瓶水，1瓶為1%蔗糖溶液，1瓶為動物日常飲用水。1 h后，記錄并計(jì)算動物的糖水偏好[糖水偏好(%)=糖水減少質(zhì)量/總液體減少質(zhì)量×100%]；(2)曠場實(shí)驗(yàn)：曠場大小為120 cm×90 cm×35 cm，實(shí)驗(yàn)在9:00～12:00進(jìn)行。將大鼠置于曠場中心內(nèi)，使用動物行為自動跟蹤系統(tǒng)記錄并分析大鼠在曠場內(nèi)5 min的行為，主要觀測指標(biāo)為總行程、中間停留時(shí)間。每只動物單獨(dú)測試，2只動物測試之間將場地清理干凈。

2.5 標(biāo)本采集 動物麻醉后斷頭，取出大腦并在冰上迅速速剝離海馬組織，置于-80 ℃冰箱保存待用。

2.6 RNA的提取及RT-PCR檢測 應(yīng)激結(jié)束后第2 天，斷頭處死大鼠，冰上快速剝離海馬組織，液氮研磨并用TRIzol法提取海馬總RNA，然后用Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒通過兩步法合成cDNA，配制反應(yīng)體系進(jìn)行RT-PCR，在凝膠成像系統(tǒng)拍下電泳圖片后，用軟件ImageJ分析基因相對灰度值表示，即目的基因與β-actin灰度測量比值。 SYP的上游引物為5’-CATCTTCGCCTTTGCTACG-3’，下游引物為 5’-CACTGAGGTGTTGAGTCCTGA-3’；GFAP的上游引物為5’-TGGTATCGGTCCAAGTTTGC-3’，下游引物為5’-TTGGCGGCGATAGTCATTAG-3’；beclin 1的上游引物為5’-TAATGTGGGGAAGGGACAAG-3’，下游引物為5’-AAATCCTCCACATCTCAAACA-3’； LC3的上游引物為5’-CCTGCTGCTGGCCGTAGT-3’，下游引物為5’-TGATGAAGTCTTCCTGCCAAAA-3’；β-actin的上游引物為5’-TCAGGTCATCACTATCGGGCAAT-3’，下游引物為5’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’。

2.7 蛋白的提取Western blotting檢測 取出海馬組織后加組織裂解液，冰上裂解30 min后4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)測定各樣品蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行SDS-PAGE(先80 V/30 min后換110 V/70 min)、凝膠濃度12%；并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(0.45/0.22 μm)，轉(zhuǎn)膜條件為電流260 mA約90 min；于5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗SYP(1∶500)、GFAP(1∶500)、beclin 1(1∶2 000)、LC3(1∶2 000)、Bcl-2(1∶1 000)、caspase 3(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、4EBP1(1∶1 000)、p-4EBP1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體 I 抗孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物標(biāo)記的 II 抗(1∶1 000)。化學(xué)發(fā)光法顯影，應(yīng)用軟件ImageJ分析蛋白相對灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 17.0處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，用SNK-q檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 對照組、CUMS組和氟西汀組體重及行為學(xué)指標(biāo)的比較

由表1可知，CUMS組體重、糖水偏好、曠場實(shí)驗(yàn)總行程和中間停留時(shí)間明顯低于正常對照組。與CUMS組相比，氟西汀組體重、糖水偏好、曠場實(shí)驗(yàn)總行程和中間停留時(shí)間明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。氟西汀組和正常對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

表1 3組之間體重、糖水?dāng)z取及行為學(xué)指標(biāo)的變化

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

2 氟西汀作用后CUMS海馬突觸重塑相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)

與對照組相比，CUMS組突觸重塑相關(guān)蛋白SYP和GFAP的mRNA和蛋白水平表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而與CUMS組相比，無論是mRNA還是蛋白水平，氟西汀組的SYP和GFAP均上調(diào)，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；對照組和氟西汀組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。這說明氟西汀可以通過改善海馬突觸重塑緩解和治療抑郁癥。

3 氟西汀作用后CUMS海馬細(xì)胞凋亡水平下調(diào)

與對照組相比，CUMS組的Bcl-2蛋白表達(dá)降低而cleaved caspase-3的蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；氟西汀處理后可以逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象；對照組和氟西汀組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。這說明氟西汀作用后CUMS海馬細(xì)胞凋亡水平降低，氟西汀可以通過降低凋亡水平來緩解抑郁癥狀。

4 氟西汀作用后CUMS海馬mTOR信號通路上調(diào)

由圖3可見，與對照組相比，CUMS組的mTOR及其下游靶分子4EBP1的磷酸化水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而與CUMS組相比，氟西汀組的mTOR及其下游靶分子4EBP1的磷酸化水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；對照組和氟西汀組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這說明氟西汀作用后CUMS海馬的mTOR信號通路上調(diào)，由此推測氟西汀通過影響mTOR信號通路調(diào)控突觸重塑蛋白的表達(dá)。

5 氟西汀作用后CUMS海馬細(xì)胞自噬水平下調(diào)

與對照組相比，CUMS組的自噬相關(guān)蛋白beclin 1和LC3 的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，尤其是LC3 II蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；與CUMS組相比，無論是mRNA還是蛋白水平，氟西汀組的beclin 1和LC3均下調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；對照組和氟西汀組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 1.The mRNA (A) and protein (B) expression of synaptic plasticity-related proteins SYP and GFAP in different groups. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

圖1 突觸重塑相關(guān)蛋白SYP和GFAP的變化

Figure 2.The changes of apoptosis signaling pathway-related proteins Bcl-2 and caspase-3 in fluoxetine-treated CUMS rats. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

圖2 氟西汀作用后凋亡信號通路相關(guān)蛋白Bcl-2和cleaved-caspase-3的變化

Figure 3.The phosphorylation levels of mTOR signaling pathway-related proteins mTOR and 4EBP1 in fluoxetine-treated CUMS rats. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

圖3 氟西汀作用后mTOR信號通路相關(guān)蛋白mTOR和4EBP1的磷酸化水平變化

討 論

抑郁癥是威脅人類健康和幸福的疾病之一，臨床數(shù)據(jù)顯示，高達(dá)45%的抑郁癥患者治療后并未改善，甚至有15%的患者對抗抑郁藥物沒有任何反應(yīng)[2]，因此，現(xiàn)有藥物的作用機(jī)制并沒有完全搞清楚，尋找新的抗抑郁藥物固然重要，但我們更宜挖掘現(xiàn)有的抗抑郁藥物的抗抑郁新機(jī)制以省去大量的人力、物力和財(cái)力。CUMS可以有效地模擬人類抑郁癥狀，成為抑郁癥研究中廣泛使用的模型[8-9]。本研究結(jié)果顯示，CUMS組大鼠在體重、糖水?dāng)z取量、曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動總距離和中間停留時(shí)間較正常對照均減少，說明大鼠表現(xiàn)出興趣喪失和快感缺乏等抑郁癥狀，抑郁模型建立成功。而氟西汀治療后，上述抑郁癥狀均明顯改善，這與國內(nèi)外的一些研究結(jié)果相一致。

Figure 4.The mRNA (A) and protein (B) expression of autophagy-related proteins beclin 1 and LC3 in fluoxetine-treated CUMS rats. Mean±SD.n=20.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCUMS.

圖4 氟西汀作用后自噬相關(guān)蛋白beclin 1和LC3的變化

突觸重塑對于海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的維持與改變有著密切關(guān)聯(lián)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，可以激活星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對突觸重塑起到關(guān)鍵作用。研究證實(shí)在抑郁癥、精神分裂癥、雙向情感障礙等患者的腦內(nèi)檢測GFAP表達(dá)均下降，并導(dǎo)致突觸重塑和神經(jīng)傳導(dǎo)等功能的異常[10]。突觸泡蛋白SYP是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞突觸小泡上的一種膜蛋白，通過激活蛋白酪氨酸激酶，使自身磷酸化并調(diào)節(jié)內(nèi)源性谷氨酸的分泌來調(diào)節(jié)突觸可塑性[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在長期皮下注射皮質(zhì)酮誘導(dǎo)形成的抑郁樣小鼠模型，SYP表達(dá)明顯下調(diào)，并出現(xiàn)神經(jīng)元功能障礙[12]。結(jié)果顯示，抑郁模型GFAP和SYP在mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)，突觸重塑受到破壞；氟西汀治療后，抑郁大鼠海馬GFAP和SYP mRNA和蛋白水平表達(dá)明顯上調(diào)，突觸重塑得到改善。

細(xì)胞凋亡普遍存在于生物界，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑郁發(fā)生時(shí)伴隨較高的細(xì)胞凋亡水平。最新研究顯示，氟西汀干預(yù)后，肺炎球菌性腦膜炎大鼠海馬凋亡比例明顯減小[13]；也有報(bào)道指出，氟西汀可以通過誘導(dǎo)AMPAR介導(dǎo)的鈣離子依賴性細(xì)胞凋亡來抑制惡性膠質(zhì)瘤的生長[14]；可見氟西汀對不同的疾病有著不同的凋亡調(diào)控方式。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氟西汀作用后，CUMS組海馬凋亡水平明顯下調(diào)，這與抑郁后海馬體積縮小也相吻合。

mTOR是一種保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化下游靶基因4EBP1和p70S6K調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯[15]，在細(xì)胞生長分化凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CUMS組mTOR和4EBP1磷酸化水平均下調(diào)，而氟西汀作用后，mTOR和4EBP1磷酸化水平均上調(diào)，所以我們認(rèn)為，氟西汀可以通過提高mTOR磷酸化水平繼而提高下游靶分子4EBP1的磷酸化水平，最終促進(jìn)突觸重塑相關(guān)蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抗抑郁作用。

細(xì)胞自噬是一種保守的溶酶體代謝途徑，可以包裹損傷的細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)入溶酶體進(jìn)行降解，對包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多種組織的代謝和功能發(fā)揮具有重要意義。因此，細(xì)胞自噬水平改變，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和突觸重塑會受到影響，并引發(fā)神經(jīng)性疾病，如阿爾茨海默病和帕金森病等[16]。抑郁患者海馬組織中LC3蛋白上調(diào)，并且藥物導(dǎo)致的長時(shí)程抑郁細(xì)胞模型自噬關(guān)鍵蛋白LC3 II表達(dá)明顯上調(diào)[17]。最新研究顯示一些抗抑郁藥如鹽酸舍曲林作用后引起自噬相關(guān)蛋白如beclin 1表達(dá)上調(diào)[18-20]，同樣提示我們細(xì)胞自噬在抑郁發(fā)生發(fā)展中起到很關(guān)鍵的作用，抗抑郁藥物有可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬發(fā)揮抗抑郁作用。本研究結(jié)果顯示，抑郁模型大鼠自噬相關(guān)蛋白LC3和beclin 1的mRNA和蛋白水平均上調(diào)，表明抑郁發(fā)生時(shí)自噬水平提高，細(xì)胞自噬可能參與抑郁的發(fā)生發(fā)展；氟西汀處理后，LC3和beclin 1在mRNA和蛋白水平表達(dá)均下調(diào)，自噬水平降低，氟西汀可能對自噬存在調(diào)控作用，氟西汀可能通過下調(diào)細(xì)胞自噬改善突觸重塑性，并緩解抑郁癥。

綜上所述，氟西汀干預(yù)后，抑郁大鼠海馬凋亡信號被抑制，細(xì)胞存活信號通路mTOR及下游靶分子磷酸化水平上調(diào)，突觸重塑相關(guān)蛋白GFAP、SYP在mRNA和蛋白水平上調(diào)，自噬相關(guān)蛋白beclin 1、LC3在mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，突觸重塑蛋白降解途徑受到抑制，顯示氟西汀可以通過調(diào)控以上信號通路緩解抑郁癥狀，改善抑郁狀態(tài)下的突觸重塑。因此我們提出假設(shè)，應(yīng)激刺激剛開始時(shí)會出現(xiàn)短暫的自噬缺陷、細(xì)胞內(nèi)積累錯(cuò)誤折疊蛋白或者破損細(xì)胞器的累積，并發(fā)生抑郁或其它神經(jīng)性疾??；隨著錯(cuò)誤折疊蛋白或者破損細(xì)胞器的累積，細(xì)胞逐漸發(fā)生高水平的凋亡，機(jī)體會做出適應(yīng)性調(diào)節(jié)，激活細(xì)胞自噬降解積累的蛋白或者細(xì)胞器，甚至發(fā)生自噬性死亡，被某種分子或信號影響后，抑郁發(fā)生后mTOR信號通路下調(diào)，隨之突觸重塑蛋白表達(dá)降低或者被細(xì)胞自噬降解而減少；氟西汀干預(yù)后，凋亡水平降低，細(xì)胞自噬水平下調(diào)，突觸蛋白降解減少，并且表達(dá)增多，受損組織狀態(tài)逐漸改善。

[1] Graber TE, Mc Camphill PK, Sossin WS. A recollection of mTOR signaling in learning and memory[J]. Learn Mem, 2013, 20(10):518-530.

[2] Strekalova T, Couch Y, Kholod N, et al. Update in the methodology of the chronic stress paradigm: internal control matters[J]. Behav Brain Funct, 2011, 7:9.

[3] 蔣 曦，田福榮，趙應(yīng)征. 小鼠慢性酒精中毒及戒斷過程中抑郁樣行為的改變及其共病機(jī)制[J]. 中國病理生理雜志，2016, 32(2):296-301.

[4] Anacker C, Cattaneo A, Musaelyan K, et al. Role for the kinase SGK1 in stress, depression, and glucocorticoid effects on hippocampal neurogenesis[J]. Proc Natl Acad Sic U S A, 2013, 110(21):8708-8713.

[5] 朱玉英，紀(jì)榮靜，熊佩黎，等. 抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率和自噬相關(guān)蛋白的改變[J]. 中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2013, 22(6):471-474.

[6] Beaulieu JM, Gainetdinov RR, Caron MG. Akt/GSK3 signaling in the action of psychotropic drugs[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2009, 49:327-347.

[7] Li M, Fu Q, Li Y, et al. Emodin opposes chronic unpredictable mild stress induced depressive-like behavior in mice by upregulating the levels of hippocampal glucocorticoid receptor and brain-derived neurotrophic factor[J]. Fitoterapia, 2014, 98:1-10.

[8] Luo KR, Hong CJ, Liou YJ, et al. Differential regulation of neurotrophin S100B and BDNF in tworat models of depression[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2010, 34(8):1433-1439.

[9] Banasr M, Chowdhuiy GM, Terwilliger R, et al. Glial pathology in an animal model of depression: reversal of stress induced cellular, metabolic and behavioral deficits by the glutamate modulating drug riluzole[J]. Mol Psychiatry, 2010, 15(5):501-511.

[10] Hoeffer CA, Klann E. mTOR signaling: at the crossroads of plasticity, memory and disease[J]. Trends Neurosci, 2010, 33(2):67-75.

[11]Nusser Z，Mulvihill E，Streit P, et al. Subsynaptic segregation of metabotropic and ionotropic glutamate receptors as revealed by immunogold localization[J]. Neuroscience, 1994, 61(3):421-427.

[12]張繪宇，趙玉男，王中立.慢性皮質(zhì)酮注射對小鼠抑郁樣行為及腦糖原水平的影響[J]. 中國病理生理雜志，2015, 31(5):828-833.

[13]Liechti FD, Grandgirard D, Leib SL. The antidepressant fluoxetine protects the hippocampus from brain damage in experimental pneumococcal meningitis[J]. Neuroscience, 2015, 297:89-94.

[14]Liu KH, Yang ST, Lin YK, et al. Fluoxetine, an antidepressant, suppresses glioblastoma by evoking AMPAR-mediated calcium-dependent apoptosis[J]. Oncotarget, 2015, 6(7):5088-5101.

[15]Kawahara T, Asthana S, Kneteman NM. m-TOR inhibitors: what role in liver transplantation? [J]. J Hepatol, 2011, 55(6):1441-1451.

[16]Takacs-Vellai K, Bayci A, Vellai T. Autophagy in neuronal cell loss: a road to death[J]. Bioessays, 2006, 28(11):1126-1131.

[17]Shehata M, Matsumura H, Okubo-Suzuki R, et al. Neuronal stimulation induces autophagy in hippocampal neurons that is involved in AMPA receptor degradation after chemical long-term depression[J]. J Neurosci, 2012, 32(30): 10413-10422.

[18]Gassen NC, Hartmann J, Schmidt MV, et al. FKBP5/FKBP51 enhances autophagy to synergize with antidepressant action[J]. Autophagy, 2015, 11(3): 578-580.

[19]Ma J, Hou LN, Rong ZX, et al. Antidepressant desipramine leads to C6 glioma cell autophagy: implication for the adjuvant therapy of cancer[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2013, 13(2):254-260.

[20]Gassen NC, Hartmann J, Zschocke J, et al. Association of FKBP51 with priming of autophagy pathways and mediation of antidepressant treatment response: evidence in cells, mice, and humans[J]. PLoS Med, 2014, 11(11): e1001755.

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Fluoxetine regulates hippocampal synaptic plasticity in CUMS depression rats

SHEN Zhong-fei, WANG Zhi-jian, PAN Wei-wei, GUO Yan-jun, FU Chun-yan, YUAN Feng-feng

(JiaxingCollegeofMedicine,Jiaxing314000,China.E-mail:shzhmy169@vip.sina.com)

AIM: To investigate the role of fluoxetine in the hippocampal synaptic plasticity in chronic unpredictable mild stress (CUMS) depression rats and its effect on mTOR and autophagy signaling pathways. METHODS: Male Sprague-Dawley rats (n=60) were randomly divided into normal control group, CUMS group and fluoxetine group. The CUMS rat model was established through CUMS combined with solitary raising, and fluoxetine (20 mg·kg-1·d-1) was administered via intragastric gavage. The changes of body weight, the ratio of sugar intake and the results of the behavioral test were recorded to identify the modeling. Moreover, the expression of synaptic plasticity-related proteins glial fibrillary acidic protein (GFAP) and synaptophysin (SYP), apoptosis-related proteins Bcl-2 and caspase-3, mTOR signaling proteins mTOR and 4EBP1, and autophagy-related proteins beclin 1 and LC3 were examined by RT-PCR and Western blot.RESULTS: Compared with control group, the body weight, sucrose intake, and total distance and intermediate residence time in the open field test were significantly decreased in CUMS group. The results of RT-PCR and Western blotting showed that the mRNA and protein levels of SYP and GFAP in CUMS group were significantly down-regulated compared with control group. The expression of Bcl-2 in CUMS group was downregulated, while the protein level of cleaved caspase-3 increased. Decreased phosphorylation levels of mTOR and its downstream target molecule 4EBP1 were observed in CUMS group. Besides, the autophagy-related proteins beclin 1 and LC3 were significantly upregulated at mRNA and protein levels. All these results(upregulation or downregulation) were attenuated by the treatment with fluoxetine, and the difference was statistically significant. CONCLUSION: Fluoxetine might improve hippocampal synaptic plasticity and alleviate symptoms of depression by supressing apoptosis/autophagy signaling pathways and upregulating mTOR signaling pathway.

Fluoxetine; Depression; Synaptic plasticity; Apoptosis; mTOR signaling pathway; Autophagy

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

1000- 4718(2016)09- 1642- 06

2015- 12- 16

2016- 07- 12

浙江省實(shí)驗(yàn)動物科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2014C37019)； 嘉興市科技局項(xiàng)目(No. 2015AY23066)

△通訊作者 Tel: 0573-83643850; E-mail: shzhmy169@vip.sina.com

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A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.09.018