類幾丁質(zhì)酶YKL-40及Toll樣受體4在慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉患者中的表達(dá)差異

王海霞　石志堅

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，新疆　石河子　832008)

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類幾丁質(zhì)酶YKL-40及Toll樣受體4在慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉患者中的表達(dá)差異

王海霞石志堅

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，新疆石河子832008)

目的探討類幾丁質(zhì)酶YKL-40及Toll樣受體(TLR)4在慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉患者中的表達(dá)差異。方法慢性鼻竇炎伴鼻息肉老年患者19例、不伴鼻息肉老年患者21例為研究組，取其竇口鼻道復(fù)合體黏膜；同期鼻中隔偏曲老年患者20例為對照組，取其下鼻甲黏膜。采用RT-PCR法檢測各組標(biāo)本中YKL-40、TLR4及核因子(NF)-κB mRNA表達(dá)情況；免疫組化法檢測標(biāo)本中YKL-40、TLR4蛋白表達(dá)強度。結(jié)果mRNA水平：伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組類幾丁質(zhì)酶YKL-40 mRNA表達(dá)均明顯高于對照組(P<0.05)；伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)均明顯低于對照組(P<0.05)。不伴鼻息肉組YKL-40、TLR4之間無相關(guān)性(r=0.087，P>0.05)；伴鼻息肉組YKL-40與TLR4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.852，P<0.05)。蛋白質(zhì)水平：YKL-40在伴鼻息肉組的表達(dá)程度明顯高于不伴鼻息肉組(P<0.01)；不伴鼻息肉組與對照組YKL-40表達(dá)程度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TLR4在伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組表達(dá)均明顯低于對照組(P<0.01)；伴鼻息肉組與不伴鼻息肉組TLR4表達(dá)程度之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。伴鼻息肉組YKL-40與TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.571，P<0.05)；不伴鼻息肉組YKL-40與TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.251，P>0.05)。結(jié)論類幾丁質(zhì)酶YKL-40在慢性鼻竇炎伴鼻息肉組織中高表達(dá)，且與TLR4呈負(fù)相關(guān)，提示二者存在交互作用，同時參與了慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發(fā)生、發(fā)展。

慢性鼻竇炎；外源凝集素類；Toll樣受體4

慢性鼻竇炎患者鼻黏膜持續(xù)的炎癥刺激可導(dǎo)致鼻息肉，嚴(yán)重影響鼻腔通氣功能。老年患者抗應(yīng)激能力較差，慢性鼻竇炎引起的通氣障礙能明顯提高患者死亡率〔1〕。類幾丁質(zhì)酶YKL-40是人體中一個大分子糖蛋白，屬于幾丁質(zhì)酶家族，但已失去水解酶活性，主要由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌。雖然YKL-40具體功能仍在探究中，但公認(rèn)其為炎性標(biāo)志物，與多種疾病的發(fā)病機制相關(guān)〔2〕。目前YKL-40在慢性鼻竇炎發(fā)病過程中的作用還少有報道。本研究擬探討YKL-40和Toll樣受體(TLR)4在老年慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉患者鼻竇黏膜中的表達(dá)差異。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2014年1月至2015年6月間來本院耳鼻喉科就診的老年慢性鼻竇炎患者40例為研究組，其中伴鼻息肉19例，男10例、女9例，年齡60～75〔平均(66.31±3.80)〕歲；不伴鼻息肉21例，男12例、女9例，年齡60～73〔平均(65.58±3.69)〕歲。兩組研究標(biāo)本取自患者竇口鼻道復(fù)合體黏膜。入選患者診斷均符合慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2012年，昆明)標(biāo)準(zhǔn)，且2個月內(nèi)未接受抗菌藥物、激素類藥物治療；慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者均為初發(fā)雙側(cè)鼻息肉。選取同期老年鼻中隔偏曲患者20例為對照組，男16例、女4例，年齡60～73〔平均(65.82±5.05)〕歲，研究標(biāo)本取下鼻甲黏膜。各組患者年齡、性別構(gòu)成之間差異無統(tǒng)計意義，入選患者均被告知研究信息，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集與處理新鮮組織標(biāo)本離體后用生理鹽水洗凈表面的血液和組織液，均勻分成兩份，一份放入無菌試管中，-80℃超低溫保存；另一份用10%甲醛溶液固定保存。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)取低溫凍存的組織標(biāo)本，Trizol法提取標(biāo)本中的總RNA，按試劑盒(上海研拓生物科技有限公司)說明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。RT-PCR檢測標(biāo)本中YKL-40、TLR4、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的mRNA相對表達(dá)量。10 μl反應(yīng)體系包塊反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 0.5 μl，濃度10 μmol/L的正、反引物0.5 μl，引物設(shè)計由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成，Real Master Mix(SYBR Green)試劑5 μl，去離子水4 μl。連續(xù)反應(yīng)40個循環(huán)，根據(jù)每孔的Ct值進(jìn)行分析。

1.2.3免疫組化檢測檢測標(biāo)本中YKL-40、TLR4蛋白含量。取10%甲醛溶液固定的組織標(biāo)本，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片。放入烘干機15 min后轉(zhuǎn)至50℃烤箱中30 min。在枸櫞酸鹽溶液中行熱修復(fù)20 min。鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)二步法進(jìn)行染色。兔抗人YKL-40、TLR4抗體工作濃度均為1∶300，4℃濕盒中孵育過夜。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色，光鏡下觀察染色到適度終止，蘇木素復(fù)染，封片。以試劑公司提供圖片為陽性對照，磷酶鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照，排除非特異性著色。結(jié)果由兩名病理學(xué)研究員雙盲獨立評分，判定標(biāo)準(zhǔn)參照Kamba等〔3〕研究。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗、χ2檢驗及Spearman相關(guān)性分析。

2　結(jié)　果

2.1YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA表達(dá)情況和相關(guān)性分析三組患者YKL-40、TLR4、NF-κB的mRNA表達(dá)水平均有統(tǒng)計學(xué)差異(F=5.691、8.726、4.253，P<0.05)。伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組YKL-40 mRNA表達(dá)均明顯高于對照組(P<0.05)；伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)均明顯低于對照組(P<0.05)。不伴鼻息肉組YKL-40、TLR4之間無相關(guān)性(r=0.087，P>0.05)；伴鼻息肉組YKL-40與TLR4呈負(fù)相關(guān)(r=-0.852，P<0.05)；對照組YKL-40、TLR4之間無相關(guān)性(r=0.014，P>0.05)。見表1。

表1　三組患者YKL-40、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)情況比較±s)

與對照組相比：1)P<0.05

2.2YKL-40、TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)水平相關(guān)性分析YKL-40、TLR4蛋白主要表達(dá)于鼻竇黏膜的上皮細(xì)胞、下腺體細(xì)胞和炎性細(xì)胞中，表達(dá)位置基本一致。YKL-40陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，而TLR4陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。見圖1。

圖1　YKL-40、TLR4蛋白在各組患者鼻黏膜組織中的表達(dá)(×200)

YKL-40在伴鼻息肉組的表達(dá)程度明顯高于不伴鼻息肉組(P<0.01)；不伴鼻息肉組與對照組YKL-40表達(dá)程度之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。TLR4在伴鼻息肉組和不伴鼻息肉組表達(dá)均明顯低于對照組(P<0.01)；伴鼻息肉組與不伴鼻息肉組TLR4表達(dá)程度之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。伴鼻息肉組YKL-40與TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.571，P<0.05)；不伴鼻息肉組YKL-40與TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.251，P>0.05)。見表2。

表2　三組患者YKL-40、TLR4蛋白質(zhì)表達(dá)水平分布(n)

3　討　論

盡管目前關(guān)于慢性鼻竇炎伴鼻息肉與不伴鼻息肉的發(fā)病機制存在超抗原、細(xì)菌生物膜、變態(tài)反應(yīng)等多種假說，但具體發(fā)病機制仍未明確。相關(guān)研究顯示，炎性腸病、哮喘患者的血清中存在YKL-40蛋白表達(dá)水平升高現(xiàn)象，且與病情進(jìn)展密切相關(guān)，還可能同時合并慢性鼻竇炎且傾向伴鼻息肉的表型〔4〕。本次研究結(jié)果說明YKL-40可能參與了慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發(fā)生、發(fā)展。相關(guān)研究顯示，慢性鼻竇炎不伴鼻息肉以輔助T細(xì)胞(Th1)反應(yīng)為主，伴息肉以Th2反應(yīng)為主，且YKL-40可能以黏蛋白細(xì)胞因子形式影響Th2反應(yīng)〔5〕。本次研究中進(jìn)一步證實了在蛋白質(zhì)水平上慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者YKL-40表達(dá)明顯強于不伴鼻息肉患者，雖然兩組在mRNA水平上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但存在表達(dá)差異的趨勢。說明YKL-40表達(dá)差異可能為慢性鼻竇炎不同表型的原因之一。

骨骼肌細(xì)胞的研究已證實，YKL-40高表達(dá)會抑制NF-κB相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，而NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子的一種，能夠在轉(zhuǎn)錄水平上對多種炎性因子表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，且NF-κB參與的信號傳導(dǎo)通路在多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，同時其在慢性鼻竇炎發(fā)病中的作用也受到關(guān)注〔6〕。本次研究顯示，伴鼻息肉組患者YKL-40高表達(dá)時，NF-κB低表達(dá)，提示YKL-40可能通過影響NF-κB通路而參與慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發(fā)生，具體分子機制仍需深入研究。

TLR4作為Toll樣受體的一種亞型，在氨基酸序列下游信號傳導(dǎo)中具有重要作用。當(dāng)配體蛋白與其胞外受體相結(jié)合時，可誘導(dǎo)生成下游低聚蛋白復(fù)合體，影響炎性反應(yīng)〔7〕。相關(guān)研究顯示，TLR4激活能夠增強NF-κB通路活性，促進(jìn)下游白細(xì)胞介素(IL)-8、環(huán)氧酶(Cox)-2炎性因子表達(dá)，增強炎性反應(yīng)，但具體分子機制尚未明確〔8〕。本次研究中對TLR4進(jìn)行檢測，結(jié)果提示在慢性鼻竇炎中TLR4通過影響NF-κB通路參與病情發(fā)生。

綜上所述，本次研究證實了慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者中存在YKL-40高表達(dá)和TLR4、NF-κB低表達(dá)，且YKL-40與TLR4之間呈明顯負(fù)相關(guān)，因此可認(rèn)為YKL-40、TLR4共同作用于NF-κB信號通路，參與慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發(fā)生。

1孫紹輝，趙松花，朱奇，等.鼻內(nèi)鏡下治療老年慢性鼻竇炎、鼻息肉的療效分析〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(7)：1667-9.

2Murad S.Tol-like receptor4 in inflammation and angiogenesis：a double edged sword〔J〕.Front Immunol，2014；5(2)：313.

3Kamba A，LeeI A，Mizoguchi E.Potential association between TLR4 and chitinase3-like1(CHl3L1/YKL-40)signaling on colonic epithelial cells in inflammatory bowel disease and colitis-associated cancer〔J〕.Curr Mol Med，2013；13(7)：1110-21.

4李昕輝，滕飛.白細(xì)胞介素23基因沉默對支氣管哮喘小鼠的影響〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015；16(1)：38-42.

5隋麗，陳冬，馬曉峰，等.老年慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞與肺功能的相關(guān)性〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(10)：2629-31.

6Guilemany JM，Alobid I，Mullol J.Controversies in the treatment of chronic rhinosinusitis〔J〕.Exp Rev Respir Med，2010；4(4)：463-77.

7Srivastava SK，Antal P，Gall J，etal.Lack of evidence for association of two functional SNPs of CHI3L1 gene(HC-gp39) with rheumatoid arthritis〔J〕.Rheumatol Int，2011，31(8)：1003-7.

8陳黛詩.高遷移率族蛋白1在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中的表達(dá)及作用機制〔D〕.北京：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2013.

〔2015-12-13修回〕

(編輯袁左鳴)

新疆維吾爾自治區(qū)科技援疆計劃(No.2014Z91172)

王海霞(1969-)，女，主管護(hù)師，主要從事耳鼻喉科研究。

R76

A

1005-9202(2016)17-4285-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.075