桑樹(shù)組培不定芽對(duì)卡那霉素的敏感性研究

劉淑娟，李鎮(zhèn)剛

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101）

桑樹(shù)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，是中國(guó)養(yǎng)蠶業(yè)的飼料基礎(chǔ)，但其組織培養(yǎng)研究起步較晚，筆者經(jīng)過(guò)多年對(duì)桑樹(shù)組培的研究與探索，已初步建立桑樹(shù)高頻再生體系。平野等1985年已證實(shí)桑樹(shù)為易感農(nóng)桿菌的植物，并且經(jīng)過(guò)多年來(lái)眾多科學(xué)家的研究報(bào)道證實(shí)了通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因操作能夠在桑樹(shù)中實(shí)現(xiàn)。

桑樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較晚，1990年日本學(xué)者M(jìn)achii通過(guò)農(nóng)桿菌將β-葡萄糖苷酸酶（Gus） 基因?qū)肷?shù)葉盤并在桑葉中表達(dá)獲得成功。自此，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者在桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因育種這一領(lǐng)域做了大量的研究和探索，有了不少對(duì)桑樹(shù)的轉(zhuǎn)基因研究報(bào)道，而抗生素對(duì)桑樹(shù)的敏感性研究則不多?？敲顾啬芨蓴_一般植物細(xì)胞葉綠體及線粒體的蛋白質(zhì)合成，引起植物綠色器官的黃化，最終導(dǎo)致植物細(xì)胞的死亡。因此本研究以桑樹(shù)的組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)，通過(guò)在桑樹(shù)叢生芽外植體繼代培養(yǎng)基中添加不同濃度卡那霉素，以確定叢生芽發(fā)生黃化的最低濃度，為下一步桑樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試品種為廣西優(yōu)良雜交桑品種桂優(yōu)62#的種子，置于4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L+葡萄糖30 g/L+瓊脂7.0 g/L+AgNO31 mg/L

繼代培養(yǎng)基：MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L+葡萄糖30 g/L+瓊脂7.0 g/L+AgNO31 mg/L

生根培養(yǎng)基：MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂7.0 g/L+AgNO31 mg/L

1.3 培養(yǎng)條件

溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為1 500 lx，每天光照12 h、黑暗12 h。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 桑樹(shù)組培外植體的獲得

參照文獻(xiàn)5的方法，于超凈工作臺(tái)上，取預(yù)培養(yǎng)萌發(fā)的種子剝離種皮，刀片切取子葉和下胚軸靠近生長(zhǎng)點(diǎn)的外植體（不帶胚芽），接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。在黑暗條件下培養(yǎng)5 d，子葉和胚軸均為乳白色，光照培養(yǎng)2～3 d后，轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色，第5 d時(shí)完全變?yōu)榫G色且體積明顯增大，15 d左右誘導(dǎo)分化，可在切口處形成愈傷組織和不定芽。

1.4.2 桑樹(shù)組培不定芽對(duì)卡那霉素敏感性試驗(yàn)

于繼代培養(yǎng)基中添加不同濃度梯度的卡那霉素以制備篩選培養(yǎng)基，將上述獲得的健康不定芽切取分割成獨(dú)立的小芽，取大小基本相同的芽接種于篩選培養(yǎng)基中，每瓶接種5個(gè)芽，每個(gè)濃度梯度接種5瓶，統(tǒng)計(jì)芽分化率和及時(shí)觀察芽的顏色形態(tài)變化。分別進(jìn)行了3次不同卡那霉素濃度篩選驗(yàn)證，其濃度梯度如下：第1次：0 mg/L，10 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，50 mg/L，100 mg/L；第 2次：0 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，75 mg/L，100 mg/L，125 mg/L；第3次：0 mg/L，30 mg/L，40 mg/L，50 mg/L，60 mg/L，70 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑樹(shù)不定芽對(duì)卡那霉素耐受濃度的確定

待上述外植體誘導(dǎo)出叢生芽后，切取大小基本相似的獨(dú)立的芽進(jìn)行卡那霉素敏感性研究。從表1可知，卡那霉素濃度在0～150 mg/L，叢生芽的增殖系數(shù)隨濃度的升高而降低，卡那霉素對(duì)叢生芽的分化具有緩慢抑制的作用。從圖1可知，芽的增殖系數(shù)并沒(méi)有出現(xiàn)急劇降低的濃度斷點(diǎn)，卡那霉素濃度在100 mg/L下叢生芽亦能分化，說(shuō)明卡那霉素可以緩慢控制叢生芽的分化率，卡那霉素濃度在150 mg/L下分化率為零，說(shuō)明高濃度卡那霉素對(duì)叢生芽的分化具有完全抑制的潛力。

從圖2可知，卡那霉素濃度在100 mg/L時(shí)可以基本認(rèn)為叢生芽的生長(zhǎng)完全受到抑制。如圖3a，白化現(xiàn)象在卡那霉素濃度為50 mg/L時(shí)出現(xiàn)，僅葉尖出現(xiàn)黃色，生長(zhǎng)和分化正常。卡那霉素濃度50 mg/L以下沒(méi)有白化現(xiàn)象，原因可能是在低濃度下，叢生芽本身的抵抗力可以維持基本生長(zhǎng)，隨濃度的增加芽的分化率降低。

表1 不同卡那霉素濃度對(duì)叢生芽分化的影響

圖1 不同卡那霉素濃度對(duì)芽增殖系數(shù)的影響

圖2 不同卡那霉素濃度與芽白化率的關(guān)系

2.2 卡那霉素對(duì)叢生芽生長(zhǎng)的影響

從表2可知，卡那霉素濃度在30～50 mg/L時(shí)叢生芽生長(zhǎng)基本不受影響，隨著卡那霉素濃度的增加其長(zhǎng)度明顯變短?？敲顾貙?duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育有影響，能夠引起玉米、小麥、煙草、番茄等多種植物綠色器官的黃化和白化，其毒性機(jī)理主要是卡那霉素與植物細(xì)胞器葉綠體和線粒體的核糖30S亞基結(jié)合，阻止翻譯過(guò)程，干擾蛋白質(zhì)合成，引起試管苗同化作用受阻，生長(zhǎng)受到抑制，長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，如圖3b，隨著卡那霉素濃度的遞增白化明顯，長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酢?/p>

表2 不同卡那霉素濃度對(duì)叢生芽生長(zhǎng)的影響

圖3 叢生芽的生長(zhǎng)情況

圖4 不同濃度叢生芽葉子顏色的變化

如圖3和圖4所示，卡那霉素濃度在50 mg/L時(shí)葉片邊緣出現(xiàn)乳黃色的現(xiàn)象，不過(guò)生長(zhǎng)未受到抑制，說(shuō)明此時(shí)的濃度已經(jīng)對(duì)芽的葉綠體與線粒體的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生了一定的干擾作用，導(dǎo)致其開(kāi)始黃化，能正常分化說(shuō)明其濃度還不足以造成芽的死亡。當(dāng)卡那霉素濃度大于60 mg/L則黃化較嚴(yán)重，芽的分化和生長(zhǎng)也受到抑制，由此選擇卡那霉素濃度50 mg/L為桑樹(shù)叢生芽遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性苗篩選的臨界濃度，則不會(huì)對(duì)桑樹(shù)叢生芽的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。

3 討論

外源基因遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)需具備以下幾個(gè)條件：用于遺傳轉(zhuǎn)化的外植體應(yīng)該要具備高效穩(wěn)定的再生能力；外植體來(lái)源要具有穩(wěn)定性；遺傳穩(wěn)定性良好；對(duì)選擇抗生素具敏感性，對(duì)農(nóng)桿菌的浸染也要具有敏感性。經(jīng)由本研究室多年的研究與探索，利用子葉和下胚軸作為外植體，通過(guò)不同濃度和種類的植物激素處理能夠穩(wěn)定的再生出桑樹(shù)植株。平野等1985年已證實(shí)桑樹(shù)為易感農(nóng)桿菌的植物，并且經(jīng)過(guò)多年來(lái)眾多科技工作者的研究報(bào)道，證實(shí)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化操作能夠在桑樹(shù)中實(shí)現(xiàn)。本研究采用桑組培外植體叢生芽為遺傳轉(zhuǎn)化操作的受體，探討了未轉(zhuǎn)化叢生芽在添加卡那霉素的培養(yǎng)基中出現(xiàn)白化現(xiàn)象但不影響正常分化的適宜濃度。在前人的研究中，大都利用葉盤轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)基因植株，而對(duì)于木本植物的桑樹(shù)而言，葉盤再生比較困難，因而制約了桑樹(shù)基因轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)程，因此本試驗(yàn)采用桑組培叢生芽作為遺傳轉(zhuǎn)化的載體，探討了卡那霉素對(duì)未轉(zhuǎn)化桑組培叢生芽的最低致死濃度，用于遺傳轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株的篩選。理論上選用的卡那霉素濃度越高選擇效果會(huì)越好，但是過(guò)高的濃度對(duì)細(xì)胞有強(qiáng)毒害性，此時(shí)細(xì)胞將快速死亡，死亡的或?qū)⒁劳龅募?xì)胞會(huì)分泌一定的毒素對(duì)臨近的細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，也不利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。在卡那霉素濃度50 mg/L時(shí)即出現(xiàn)葉尖白化現(xiàn)象但能正常生長(zhǎng)、分化，卡那霉素濃度在60 mg/L及以上時(shí)桑組培外植體叢生芽的分化和芽的伸長(zhǎng)均受到較大程度的抑制，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，筆者選擇卡那霉素濃度50 mg/L為桑組培叢生芽作為遺傳轉(zhuǎn)化受體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化苗的篩選臨界濃度。

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