甘蔗開放式組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

李 松，劉紅堅(jiān)，劉 欣，劉俊仙，余坤興，盧曼曼，劉麗敏，何毅波

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530007）

甘蔗開放式組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

李 松，劉紅堅(jiān)，劉 欣，劉俊仙，余坤興，盧曼曼，劉麗敏，何毅波

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530007）

以濃度為1 000 mg/L次氯酸鈉為抑菌劑，在甘蔗開放式組織培養(yǎng)條件下，對MS培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽、蔗糖、激素等因素進(jìn)行調(diào)整試驗(yàn)，觀察甘蔗腋芽誘導(dǎo)分化芽數(shù)、增殖情況等。結(jié)果表明：（1）在抑菌劑作用下，污染率高低與無機(jī)鹽濃度、6-BA濃度高低不呈相關(guān)性，但污染率隨蔗糖濃度的提高而提高；（2）無機(jī)鹽濃度、蔗糖濃度高低對甘蔗腋芽誘導(dǎo)分化有影響，規(guī)律性不明顯；甘蔗腋芽誘導(dǎo)分化率隨6-BA濃度的提高而提高；（3）無機(jī)鹽、6-BA、蔗糖等因素隨濃度的增加對芽的繁殖有促進(jìn)作用。

自1934年美國學(xué)者White等用番茄（Lycopersicume scuien-tum）根首次建立無性繁殖系以來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為生物技術(shù)的重要組成部分，越來越受到人們的關(guān)注，時至今日，各種植物幾乎都有進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道，該技術(shù)作為一種高效的植物快速繁殖技術(shù)顯示出了巨大的應(yīng)用價值。甘蔗是我國重要的糖料作物，其種植面積、產(chǎn)糖量均占全國總量的90%左右。甘蔗屬無性繁殖作物，生長時間長、用種量大，其繁殖速度慢，大大限制了新良種的推廣應(yīng)用。從20世紀(jì)70年代開始，我國應(yīng)用植物組培技術(shù)進(jìn)行甘蔗生物快繁研究，工廠化培育甘蔗組培苗已有40 a以上的歷史［1］。由于傳統(tǒng)甘蔗組織培養(yǎng)要求嚴(yán)格的無菌環(huán)境，需要特定的儀器設(shè)備、繁雜的操作程序及技術(shù)要求，生產(chǎn)成本高，這大大地限制了該技術(shù)的應(yīng)用和推廣。為了簡化組織培養(yǎng)程序，降低生產(chǎn)成本，借鑒前人［2］在荸薺［3］、白菜［4］、香蕉［5-6］、魔芋［7-9］、紅豆杉［8］、梅花［10］和馬鈴薯［11］等植物建立的開放式組織培養(yǎng)技術(shù)體系，開展相關(guān)技術(shù)研究，篩選出次氯酸鈉可應(yīng)用于甘蔗開放式組織培養(yǎng)（相關(guān)研究結(jié)果已撰寫論文待發(fā)表）。試驗(yàn)以1 000 mg/L次氯酸鈉為抑菌劑，通過對培養(yǎng)基中蔗糖、無機(jī)鹽、激素等用量進(jìn)行調(diào)整，研究開放式組織培養(yǎng)條件下的甘蔗快繁技術(shù)，為甘蔗開放式組織培養(yǎng)提供較佳的組培快繁技術(shù)實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試甘蔗品種為新臺糖22號；次氯酸鈉購于南寧市精密儀器儀表有限公司，有效濃度為10%。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)以不同濃度的無機(jī)鹽、蔗糖、激素各設(shè)3個處理，處理組的MS培養(yǎng)基中加入次氯酸鈉溶液，濃度1 000 mg/L，分裝在250 m L培養(yǎng)瓶中，pH值5.8；對照組MS培養(yǎng)基中不加次氯酸鈉溶液。每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)接種100個腋芽。試驗(yàn)培養(yǎng)基不經(jīng)過高溫滅菌，接種在相對潔凈的普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行；對照培養(yǎng)基經(jīng)過高溫滅菌，消毒、接種、培養(yǎng)等按組織培養(yǎng)常規(guī)操作進(jìn)行；接種后每15 d更換一次新鮮培養(yǎng)基，30 d觀察甘蔗腋芽分化情況，60 d統(tǒng)計(jì)叢芽增殖生長狀況。

1.2.1 無機(jī)鹽濃度處理 無機(jī)鹽設(shè)4個濃度處理，培養(yǎng)基配方為：A1：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；A2：1/2 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；A3：1/4 MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；A4：1/8 MS +BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；ACK：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

1.2.2 蔗糖濃度處理 蔗糖設(shè)4個濃度處理，培養(yǎng)基配方為：B1：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖10 g/L；B2：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗 糖20 g/L；B3：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗 糖30 g/L；B4：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L；BCK：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

1.2.3 激素濃度處理 激素以6-BA進(jìn)行相關(guān)濃度試驗(yàn)。設(shè)4個濃度處理，培養(yǎng)基配方為：C1：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；C2：MS+BA 1.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L蔗 糖+30 g/L；C3：MS+BA 2.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；C4：MS+BA 2.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L；CCK：MS+BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L。

1.3 觀察內(nèi)容及方法

1.3.1 污染率 試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)瓶后第3 d開始，每隔2 d調(diào)查1次，把污染瓶去掉并記錄。污染率=污染瓶數(shù)/轉(zhuǎn)瓶總數(shù)×100%。

1.3.2 腋芽誘導(dǎo)分化率 試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)瓶后第10 d開始，每隔4 d調(diào)查1次腋芽萌發(fā)生長情況，以腋芽萌發(fā)出新苗為準(zhǔn)，得出腋芽誘導(dǎo)分化率。腋芽誘導(dǎo)分化率=腋芽萌發(fā)數(shù)/接種腋芽總數(shù)×100%（污染瓶數(shù)不列入統(tǒng)計(jì)）。

1.3.3 腋芽增殖速度 腋芽接種培養(yǎng)90 d后，統(tǒng)計(jì)每芽系（瓶）的苗數(shù)，計(jì)算腋芽增殖苗數(shù)。腋芽增殖苗數(shù)=總苗數(shù)/接種腋芽總數(shù)（污染瓶數(shù)不列入統(tǒng)計(jì)）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)收集整理采用Excel表，方差分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同無機(jī)鹽濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

由表1可見，在污染方面，污染率最低為ACK處理，只有4.33%，最高為A2處理，6.00%，經(jīng)方差分析，各處理污染差異不顯著；在甘蔗腋芽誘導(dǎo)分化率方面，分化率最高為ACK處理，達(dá)85.62%，其余處理從高到低依次為：A2＞A1＞A4＞A3，經(jīng)方差分析，ACK與A1、A2和A4差異不顯著，與A3差異達(dá)顯著水平；在芽增殖方面，以ACK最多，平均每個腋芽繁殖20.2株，其次是A1，為16.5株，A2為15.3株，A4最少，只有12.9株苗，經(jīng)方差分析，ACK與各處理均達(dá)極顯著水平，A1與A2差異不顯著，A1與A3差異達(dá)顯著水平，A1與A4差異達(dá)極顯著。

表1 不同無機(jī)鹽濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

2.2 不同蔗糖濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

由表2可見，在污染方面，污染率最低為B1處理，4.00%，最高為B4處理，6.67%，經(jīng)方差分析，BCK與各處理差異不顯著；在甘蔗腋芽誘導(dǎo)分化率方面，分化率最高為B4處理，84.13%，其余處理從高到低依次為：BCK＞B2＞B1＞B3。經(jīng)方差分析，BCK與B3差異達(dá)極顯著水平，與其他處理差異不顯著；在芽增殖方面，以BCK最多，平均每個腋芽繁殖23.7株，其次是B3，為19.5株；B1最少，只有8.2株。經(jīng)方差分析，BCK與各處理差異均達(dá)極顯著水平，B3、B4間差異不顯著，與B1、B2差異達(dá)極顯著水平。

表2 不同蔗糖濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

2.3 不同激素濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

由表3可見，在污染方面，污染率最低為C4處理，只有4.00%，最高為C3處理，6.00%，經(jīng)方差分析各處理間差異不顯著；在腋芽誘導(dǎo)分化率方面，分化率最高為CCK處理，87.4%，其余處理從高到低依次為：C3＞C4＞C2＞C1。經(jīng)方差分析，BCK與各處理差異均達(dá)極顯著水平，C3、C4間差異不顯著，與C1、C2差異達(dá)極顯著水平；在芽增殖方面，以CCK最多，平均每個腋芽繁殖24.1株，其次是C3，為22.8株，C1最少，只有19.6株，方差分析各處理間差異情況與腋芽誘導(dǎo)分化率相似。

表3 不同激素濃度處理對甘蔗組培苗繁育的影響

3 討論與結(jié)論

培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽為植物組織培養(yǎng)過程提供必需的大量元素和微量元素，是植物細(xì)胞和組織生長必不可少的，缺少這些物質(zhì)會導(dǎo)致生長、發(fā)育異常。無機(jī)鹽濃度試驗(yàn)結(jié)果表明，在開放式培養(yǎng)中，污染率最低為對照，但對照與各處理間污染率差異不顯著，說明無機(jī)鹽濃度高低對污染率影響不大；對甘蔗腋芽誘導(dǎo)分化有影響，但沒有規(guī)律性；對苗的增殖影響最大，隨無機(jī)鹽濃度的降低，甘蔗組培苗增殖數(shù)量而減少，且因營養(yǎng)不足蔗苗生長也表現(xiàn)出比較弱小。綜合污染率、芽分化、苗增殖等因素考慮，在開放式培養(yǎng)中無機(jī)鹽濃度以原MS基本培養(yǎng)基濃度為宜。

植物組織培養(yǎng)過程以自養(yǎng)為主、異養(yǎng)為輔的寄生型育苗過程。植物所需的碳源和能量大部分由培養(yǎng)基中的蔗糖提供，同時，蔗糖也是微生物孳生的主要原因。試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖濃度為1%時污染率最低，隨著蔗糖濃度的提高，污染率有上升的趨勢，研究結(jié)果與吳桂容等［3］在荸薺的開放式組織培養(yǎng)中相似。蔗糖濃度的高低對芽分化有一定的影響，但影響差異不大，其原因可能是接的芽組織較大，自身攜帶有一定的營養(yǎng)物質(zhì)供其在分化過程中利用；雖然隨著蔗糖濃度的提高其污染率升高，但其芽繁殖數(shù)也隨之升高，3%的蔗糖濃度有利于甘蔗繁殖，結(jié)果與趙青華等［9］在磨芋的開放式組織培養(yǎng)中研究相似。綜合污染率、芽分化、苗增殖等因素考慮，在開放式培養(yǎng)中蔗糖濃度以3%較適宜。

組織培養(yǎng)中不同植物所需的激素的種類和濃度不同；同一植物，不同的培養(yǎng)階段其所需的激素的種類和濃度也不同。在甘蔗組培快繁中，常用的激素種類相對簡單，愈傷組織脫分化為2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、愈傷組織再分化與組培苗增殖為6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）與NNA（萘乙酸）、生根培養(yǎng)為NAA。試驗(yàn)中以甘蔗腋芽為供體，所用激素為6-BA與NNA，試驗(yàn)只對6-BA進(jìn)行不同濃度處理。結(jié)果表明，6-BA濃度高低與污染率高低無關(guān)；隨6-BA濃度的增加，腋芽誘導(dǎo)分化率與苗的增殖數(shù)量芽增殖等相應(yīng)提高。由于未設(shè)置太多的激素組合處理，試驗(yàn)結(jié)果僅供參考。綜合污染率、芽分化、苗增殖等因素考慮，在開放式培養(yǎng)中6-BA濃度以1.5～2.0 mg/L較適宜。

植物開放式組織培養(yǎng)技術(shù)對環(huán)境無嚴(yán)格的無菌要求、操作程序簡化，成本降低，是未來植物組織培養(yǎng)發(fā)展的主要方向。試驗(yàn)中添加的次氯酸鈉，雖然對組織培養(yǎng)過程中的微生物生長有較好的抑制作用，實(shí)現(xiàn)了開放式培養(yǎng)；但同時，次氯酸鈉對甘蔗組培苗的繁育也有抑制作用，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方式相比，在培養(yǎng)基中添加抑菌劑繁育的甘蔗組培苗較弱。

綜上所述，在MS+BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/ L+蔗糖30‰+次氯酸鈉1 000 mg/L的培養(yǎng)基中，腋芽繁殖速度較快，可在甘蔗開放式組織培養(yǎng)中使用；但腋芽增殖速度與組培苗素質(zhì)仍低于對照。因此，篩選出既能抑菌又不影響外植體生長的抑菌劑是植物開放式組織培養(yǎng)技術(shù)的核心，也是開放式培養(yǎng)在生產(chǎn)中成功應(yīng)用的前提。

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（責(zé)任編輯：夏亞男）

Technology Research of Open Tissue Culture for Sugarcane Rapid Propagation

LI Song，LIU Hong-jiang，LIU Xin，LIU Jun-xian，YU Kun-xin，LU Man-man，LIU Li-m in，HE Yi-bo
（The Sugarcane Research Institute， GXAAS， Collaborative Innovation Center of Sugarcane Industry， Nanning 530007， PRC）

Under the condition of open tissue culture with 1000 mg/L sodium hypochlorite as bacteriostatic agent， the MS composition of inorganic salt， sucrose， hormone， etc. were tested by instigation of sugarcane axillary bud differentiation， proliferation， etc.. The results showed that： （1） pollution rate was not signif cant among concentrations of inorganic salt and the 6-BA and signif cant among sucrose concentrations with the increase of sucrose concentration. （2） The sugarcane axillary bud differentiation was affected by the concentration of inorganic salt， sucrose without regularity and increased with 6-BA concentration increased. （3） The shoot propagation increased with concentration increased of inorganic salts， 6-BA and sucrose. It was concluded that with medium of MS +1.5-2.0 mg/L BA + 0.1mg/L NAA + 30‰ sucrose +1 000 mg/L sodium hypochlorite， the axillary bud propagation was faster and can be used in the sugarcane open tissue culture. However， the proliferation rate and the shoot quality were lower than controls.

sugarcane； open tissue culture； rapid propagation

S566.1；Q943.1

A

1006-060X（2016）09-0001-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.001

2016-06-20

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014GXNSFAA118090）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目（2015JZ06）

李 松（1964-），男，廣西博白縣人，研究員，研究方向：甘蔗生物技術(shù)、誘變育種與栽培。

可見，在MS+BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30‰+次氯酸鈉1 000 mg/L的培養(yǎng)基中，腋芽繁殖速度較快，可在甘蔗開放式組織培養(yǎng)中使用；但腋芽增殖速度與組培苗素質(zhì)仍低于對照。關(guān)鍵詞：甘蔗；開放式組培；快繁技術(shù)