TET蛋白、TDG介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化的研究進(jìn)展

石佳　匡野　宋杰

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·綜述·

TET蛋白、TDG介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化的研究進(jìn)展

石佳匡野宋杰

DNA甲基化在基因組的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中都有深遠(yuǎn)的影響。近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)TET(ten-eleven translocation)蛋白家族的研究突破大大提高了人們對(duì)DNA去甲基化的理解。5-甲基胞嘧啶(5mC)是DNA去甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵中間體，它能通過(guò)與復(fù)制相關(guān)的DNA被動(dòng)去甲基化途徑或經(jīng)過(guò)氧化、還原及胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)的DNA主動(dòng)去甲基化途徑，最終將5mC還原為胞嘧啶。許多證據(jù)表明DNA主動(dòng)去甲基化過(guò)程具有重要的生物學(xué)意義。該文綜述了近年來(lái)DNA主動(dòng)去甲基化的研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述了TET蛋白、TDG介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化途徑的新進(jìn)展，為進(jìn)一步的深入研究提供理論支持。

DNA主動(dòng)去甲基化；TET蛋白；胸腺嘧啶DNA糖苷酶

DNA甲基化在基因組的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中有深遠(yuǎn)影響[1]。DNA甲基化主要為胞嘧啶甲基化，即形成5-甲基胞嘧啶(5mC)。5mC轉(zhuǎn)換為胞嘧啶即為DNA去甲基化。DNA去甲基化是一種相對(duì)穩(wěn)定且可遺傳的表觀遺傳標(biāo)記，在基因表達(dá)調(diào)節(jié)、X染色體失活、基因組印記和癌癥發(fā)生等方面均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[2]。DNA甲基化/去甲基化處于一種動(dòng)態(tài)平衡，以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并受到嚴(yán)格調(diào)控，與個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育與生理活動(dòng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。DNA去甲基化在不同的生物環(huán)境中均可發(fā)生，可有主動(dòng)方式和被動(dòng)方式[3]。雖然DNA被動(dòng)去甲基化已經(jīng)得到普遍理解和接受，但是DNA主動(dòng)去甲基化的發(fā)生機(jī)制仍備受爭(zhēng)議[4]。近年醫(yī)學(xué)界的一系列發(fā)現(xiàn)大大提高了我們對(duì)DNA主動(dòng)去甲基化的理解程度，筆者回顧了這些重大發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)意義，重點(diǎn)闡述了TET(ten-eleven translocation)蛋白、胸腺嘧啶DNA糖苷酶(TDG)介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化途徑的新進(jìn)展，為進(jìn)一步探索相關(guān)領(lǐng)域提供理論支持。

一、DNA去甲基化及其可能機(jī)制

1.DNA去甲基化簡(jiǎn)介

DNA去甲基化是指 5mC被胞嘧啶代替的過(guò)程。DNA被動(dòng)去甲基化即與復(fù)制相關(guān)的DNA去甲基化，是指在DNA的復(fù)制過(guò)程中因DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)活性受抑制導(dǎo)致新合成鏈上5mC連續(xù)丟失,使DNA甲基化程度隨著DNA復(fù)制逐漸降低[5]。DNA主動(dòng)去甲基化的機(jī)制不涉及DNA復(fù)制，是指利用酶的直接去除或修飾等機(jī)制作用使5mC轉(zhuǎn)化為胞嘧啶。在DNA主動(dòng)去甲基化過(guò)程中，一方面可由酶催化直接去除5mC甲基基團(tuán)；另一方面是細(xì)胞利用堿基或核苷酸切除等DNA損傷修復(fù)機(jī)制，將5mC或經(jīng)化學(xué)基團(tuán)修飾后的5mC轉(zhuǎn)化為胞嘧啶[4]。

2.DNA主動(dòng)去甲基化

許多研究顯示，在很多生物環(huán)境中均可發(fā)生DNA主動(dòng)去甲基化[4,6]。在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的幾個(gè)階段，均有DNA甲基化途徑的建立與編碼，兩者具有相關(guān)性。首先，在精子穿透卵子，父系和母系基因組融合發(fā)生前，父系基因組經(jīng)過(guò)復(fù)雜的重構(gòu)過(guò)程，包括組蛋白H3.3沉積和DNA甲基化的重塑[7]。在父系基因組，而不是母系基因組，發(fā)生了5mC的快速丟失，此亦是DNA主動(dòng)去甲基化過(guò)程[8]。在胚胎植入及發(fā)育的早期，外胚層的細(xì)胞可以發(fā)育成為原始生殖細(xì)胞,原始生殖細(xì)胞可以通過(guò)全基因組的DNA去甲基化或是通過(guò)生殖細(xì)胞特有的方式，例如減數(shù)分裂，來(lái)完成復(fù)雜的表觀遺傳編程過(guò)程[9]。DNA的主動(dòng)去甲基化除了在受精卵和原始生殖細(xì)胞中發(fā)生，在快速應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激及有絲分裂后的細(xì)胞的特定位點(diǎn)基因中也會(huì)出現(xiàn)，這些均支持DNA主動(dòng)去甲基化途徑與DNA復(fù)制具有相關(guān)性的觀點(diǎn)[10-11]。有研究表明，F(xiàn)OXP3基因啟動(dòng)子甲基化水平升高后，F(xiàn)OXP3基因蛋白表達(dá)水平下調(diào)，引起免疫耐受異常,可能引發(fā)復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)[12]。這些均提示DNA甲基化途徑在早期胚胎植入及發(fā)育起到重要的作用。

3.DNA去甲基化可能機(jī)制

很多學(xué)者提出，某些已知的DNA修飾酶參與DNA去甲基化途徑，并起重要的作用[13-14]。最近的研究顯示，激活誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶(AID)能夠指出基因組的錯(cuò)配，TDG能夠切除修復(fù)基因組，其他的修復(fù)因子，甚至是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶均被認(rèn)為參與DNA的去甲基化，盡管這些酶的作用得到了證實(shí)，但仍然只是針對(duì)單個(gè)途徑的研究。DNA去甲基化涉及到多條調(diào)節(jié)途徑，目前對(duì)于哪條途徑起到相對(duì)重要作用仍未達(dá)成一致[13-14]。目前，3種可能參與DNA主動(dòng)去甲基化的途徑被提出：①DNA氧化基因被動(dòng)稀釋；②5mC甲基基團(tuán)的直接去除；③堿基或核苷酸切除等DNA損傷修復(fù)機(jī)制。對(duì)于DNA氧化基團(tuán)的被動(dòng)稀釋被歸于DNA主動(dòng)去甲基化或是DNA被動(dòng)去甲基化，仍存在爭(zhēng)議，目前大部分學(xué)者認(rèn)為將其歸于DNA主動(dòng)去甲基化更為合理，因?yàn)镈NA氧化基團(tuán)在被動(dòng)稀釋之前，需要被主動(dòng)修飾，即5mC氧化生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)的修飾過(guò)程，之后通過(guò)TET蛋白、TDG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化為胞嘧啶[15]。

二、TET蛋白介導(dǎo)的5mC氧化

TET蛋白家族是一個(gè)新的DNA修飾酶家族，包括TET1、TET2、TET3，均屬于α-酮戊二酸(α-KG)和二價(jià)鐵離子依賴的雙加氧酶，其催化涉及氧化過(guò)程[16]。TET蛋白家族能夠?qū)?mC氧化為5hmC[17]。5hmC是DNA去甲基化途徑的重要中間體，研究顯示，5hmC在大多數(shù)類型細(xì)胞中均有積累，被稱為“第六堿基”，5hmC在基因組中可能有獨(dú)特的表觀遺傳作用[18]。TET蛋白能將5hmC進(jìn)一步氧化為5-胞嘧啶甲酰(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)[17,19]。5hmC、5fC和5caC是胞嘧啶的不同化學(xué)修飾形式，可以被不同的DNA蛋白特異性識(shí)別，也具有不同的空間排列和電子性質(zhì)，三者的 N-糖苷鍵均不穩(wěn)定，從而促進(jìn)5hmC、5fC和5caC的相互轉(zhuǎn)化[20-21]。5hmC、5fC、5caC均是DNA去甲基化過(guò)程中的中間體。有研究表明，TET1與TDG可以通過(guò)TET1的N-C端和C-C端相互作用形成復(fù)合物，從而完成DNA主動(dòng)去甲基化過(guò)程[22]。TET1和TET3還含有與染色質(zhì)相關(guān)的鋅指結(jié)構(gòu)域(CXXC)，能夠與已知的CpG序列結(jié)合，而TET2缺失CXXC結(jié)構(gòu)，TET2的CXXC結(jié)構(gòu)進(jìn)化為一個(gè)獨(dú)立的基因IDAX，IDAX可以直接與TET2的催化結(jié)構(gòu)域相互作用，從而使TET2的表達(dá)下降[23]。

三、TDG介導(dǎo)的修復(fù)循環(huán)

TDG屬于單功能尿嘧啶 DNA 糖苷酶超級(jí)家族中的分支。TDG被認(rèn)為可能是參與切除胞嘧啶的修飾基因，并與堿基切除修復(fù)途徑密切相關(guān)[24]，因此近年來(lái)被廣泛研究。TDG主要存在于CpG位點(diǎn)，其能識(shí)別并修復(fù)DNA中的T∶G錯(cuò)配[25]。此外，TDG有特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其含有一個(gè)結(jié)合口袋，在激活誘導(dǎo)的AID和載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(APOBEC)家族的協(xié)助作用下，能特異性容納胞嘧啶的修飾基團(tuán)，介導(dǎo)識(shí)別5fC和5caC等[26]。此外，5fC、5caC與5mC、5hmc相比，因5fC和5caC具有相對(duì)不穩(wěn)定的糖苷鍵，因此5fC和5caC更易通過(guò)堿基切除修復(fù)途徑被轉(zhuǎn)化為胞嘧啶，從而實(shí)現(xiàn)DNA去甲基化[27]。植物能利用此機(jī)制直接切除5mC，有研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物中，甲基化CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白4 和TDG有類似的生物活性作用[28]。TDG已被證明與許多轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)修飾酶 、DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶相互作用，為TDG在DNA去甲基化的生物作用增添了證據(jù)[29]。繼TET蛋白家族被發(fā)現(xiàn)后，TDG被發(fā)現(xiàn)是DNA去甲基化的另一個(gè)重要里程碑。與其他的DNA糖基酶不同，TDG在胚胎發(fā)育中具有必要作用，而其他DNA糖基酶不具有此作用[30-31]。

四、重新審視DNA主動(dòng)去甲基化

近年來(lái)的研究進(jìn)展需要我們對(duì)經(jīng)典的被動(dòng)和主動(dòng)DNA去甲基化的定義重新進(jìn)行審視。正如我們已經(jīng)指出的，DNA被動(dòng)去甲基化似乎是對(duì)DNA復(fù)制依賴型5mC連續(xù)丟失最適合的描述，因?yàn)檫@種5mC丟失不涉及主動(dòng)修飾 ，即5mC氧化生成5hmC的修飾過(guò)程，只是自身結(jié)構(gòu)的改變。鑒于我們目前的理解，TET蛋白、TDG介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化可以被看作2個(gè)均涉及主動(dòng)修飾的途徑：一種途徑是，氧化生成的5hmC可通過(guò)在DNA復(fù)制過(guò)程中的被動(dòng)稀釋進(jìn)一步還原為胞嘧啶；另一種途徑是，通過(guò)酶的作用進(jìn)行主動(dòng)修復(fù)完成DNA主動(dòng)去甲基化[32]。目前，我們把5hmC在DNA復(fù)制過(guò)程中被動(dòng)稀釋進(jìn)一步還原為胞嘧啶也歸為主動(dòng)去甲基化，似乎更利于對(duì)DNA主動(dòng)去甲基化的理解[15]。

五、DNA去甲基化途徑的調(diào)控

DNA甲基化/去甲基化處于一種動(dòng)態(tài)平衡，胞嘧啶及其氧化基團(tuán)組成循環(huán)通路，是什么在此循環(huán)中調(diào)控中間體對(duì)其進(jìn)行調(diào)控? 5hmC在通路中的平衡可以通過(guò)調(diào)節(jié)TET蛋白對(duì)5hmC的氧化，通過(guò)翻譯后修飾或與蛋白質(zhì)相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)[15]。目前的研究顯示，相較于5fC和5caC， 5hmC在DNA去甲基化途徑中具有更重要的作用[33]。通過(guò)改變酶的動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)可以平衡5hmC的生化水平。但TET蛋白對(duì)5hmC、5mC、5fC三者氧化能力高低的影響尚未明確。TET蛋白的催化結(jié)構(gòu)域也許是解密調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。5fC和5caC是去甲基化過(guò)程中的類似標(biāo)志物，均由氧化生成，也均可被 TDG識(shí)別切除，但它們可以扮演不同角色。TDG對(duì)5fC顯示出較高的親和力，利用不同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)5fC和5caC的切除[21，34]。由于5fC和5caC的表達(dá)量少，尚未清楚這些胞嘧啶氧化基團(tuán)是僅僅作為主動(dòng)去甲基化途徑中的中間體，還是也與功能基因組有顯著的相互作用[35]。

六、重新審視DNA去甲基化的生物作用

隨著我們對(duì)TET蛋白、TDG介導(dǎo)的DNA去甲基化途徑研究的不斷進(jìn)展，我們也將從新的視角對(duì)DNA去甲化的生物作用進(jìn)行重新理解。異常DNA甲基化是腫瘤細(xì)胞的突出特點(diǎn)，這提示DNA去甲基化途徑可能有助于癌癥的發(fā)生與發(fā)展[36-37]?？梢猿醪酱_定TET1在急性髓系白血病患者中起到融合混合細(xì)胞系白血病基因MLL的作用[38]。滅活的TET2突變基因也已經(jīng)被證明是髓系惡性腫瘤中的常見病變[39]。TET1及TET2突變基因被證明有抑制DNA甲基化途徑的作用[40]。另有動(dòng)物模型研究顯示TET2是造血干細(xì)胞的自我更新和分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[41]。雖然大多數(shù)的研究都集中在TET蛋白在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的異常表達(dá)，但是研究者發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌和前列腺癌患者中TET蛋白表達(dá)量下調(diào)[42]。研究顯示，TET基因突變與5hmC表達(dá)量降低密切相關(guān)[42]。TDG與癌癥的發(fā)生發(fā)展也具有密切的聯(lián)系，但TDG與癌癥的聯(lián)系到底是由于TDG本身的修復(fù)錯(cuò)配作用，還是由于其在DNA主動(dòng)去甲基化途徑中所起的作用引起的，尚需進(jìn)一步探究[29]。

七、結(jié)　語(yǔ)

目前，DNA被動(dòng)去甲基化的機(jī)制已經(jīng)基本達(dá)成共識(shí)，但關(guān)于DNA主動(dòng)去甲基化的具體機(jī)制尚未清楚。隨著相關(guān)研究的逐漸深入，越來(lái)越多的與DNA去甲基化相關(guān)的蛋白被相繼發(fā)現(xiàn)，提示DNA主動(dòng)去甲基化有多種途徑，而TET蛋白、TDG介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化途徑占有重要地位。DNA去甲基化的候選酶有著相似的活性，從而增加了研究的復(fù)雜性與不確定性。因此，只有從全局考慮，綜合探索DNA主動(dòng)去甲基化的模式和評(píng)價(jià)去甲基化相關(guān)蛋白的作用，才能更全面地闡明DNA主動(dòng)去甲基化的調(diào)控機(jī)制及其與臨床疾病的關(guān)系，這也是未來(lái)研究的主要方向。

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Research progress of TET enzyme- and TDG-mediated DNA active demethylation

ShiJia,KuangYe,SongJie.

DepartmentofObstetricsandGynaecology,theSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China

Correspondingauthor,KuangYe

DNA methylation exerts a profound effect upon the genome stability, transcription and translation processes. In recent years, breakthrough studies of ten-eleven translocation (TET) enzyme family significantly deepen our understanding of DNA demethylation.5-Hydroxymethylcytosine (5mC), as a key intermediate of DNA demethylation, can eventually reduce 5mC to cytosine either through replication-related passive DNA demethylation pathway or DNA active demethylation pathway of base excision repair (BER) mediated by oxidation, reduction and thymine-DNA glycosylase (TDG). Accumulated evidence has demonstrated that DNA active demethylation is of pivotal biological significance. This article summarized the research progress of DNA active demethylation in recent years, especially the research progress of TET and TDG-mediated DNA active demethylation, providing theoretical reference for further investigations.

DNA active demethylation; Ten-eleven translocation enzyme; Thymine-DNA glycosylase

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.09.002

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目(QC2014C098)；2015年度黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金(LBH-Q15099)

150086 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，研究生(石佳)

，匡野

2016-05-21)(本文編輯：洪悅民)