化瘀通脈方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型兔一氧化氮、內(nèi)皮素-1表達(dá)的影響

楊曉妮　李長生　陳　超　程廣清　邵　聰

(千佛山醫(yī)院中醫(yī)科，山東　濟(jì)南　250014)

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化瘀通脈方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型兔一氧化氮、內(nèi)皮素-1表達(dá)的影響

楊曉妮李長生陳超程廣清邵聰1

(千佛山醫(yī)院中醫(yī)科，山東濟(jì)南250014)

目的觀察化瘀通脈方對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)模型兔一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素(EP)-1表達(dá)的影響。方法取雄性健康新西蘭大耳白兔40只，隨機(jī)分為空白組、模型組、對(duì)照組、治療組，每組10只。采用免疫損傷加高脂飼料喂養(yǎng)方法建立新西蘭大耳兔AS模型。測定血清NO、血漿ET-1水平。結(jié)果實(shí)驗(yàn)8 w末，AS兔血清ET-1顯著升高，而NO顯著降低(P<0.05，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)16 w末，治療組血清ET-1水平較模型組顯著降低，NO較模型組顯著升高(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論化瘀通脈方具有較好的抗AS作用，這可能與其能有效地調(diào)節(jié)NO/ET-1平衡有關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化；化瘀通脈方；一氧化氮；內(nèi)皮素-1

研究表明〔1〕，內(nèi)皮功能失調(diào)是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的首發(fā)步驟。一氧化氮(NO)為內(nèi)皮衍生的舒血管因子，具有松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集的作用。內(nèi)皮素(ET)是迄今所知作用最強(qiáng)烈的縮血管物質(zhì)。NO與ET之間平衡的破壞，是動(dòng)脈內(nèi)皮受損的顯著特征，并參與AS進(jìn)程?；鐾}方具有化瘀通脈，祛痰健脾功效，臨床治療AS療效顯著〔2〕。本研究探討化瘀通脈方對(duì)AS兔NO、ET-1表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組健康純種新西蘭大耳白兔40只，普通級(jí)，雄性，4～6月齡，體重2.0～2.5 kg，山東省農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：20040013。實(shí)驗(yàn)前喂飼普通飼料，觀察健康兔1 w。隨機(jī)分成空白組、模型組、對(duì)照組、治療組，每組10只，模型組實(shí)驗(yàn)中死亡1只。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器步長腦心通膠囊：陜西咸陽步長制藥有限公司提供，產(chǎn)品批號(hào)：Z20025001；化瘀通脈方藥物組成：丹參、黨參、天麻、薏苡仁、川芎、生山楂、郁金等，以上藥物均由江陰天江藥業(yè)有限公司提供的中藥配方免煎顆粒劑，批號(hào)：0611158。Beckman低溫高速離心機(jī)(DL-S型)；752紫外光柵分光光度計(jì)；放射免疫γ計(jì)數(shù)儀(SN 2682B 型)；牛血清白蛋白(德國Sigma公司進(jìn)口分裝，批號(hào)：060511)；ET放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)：20070110)；NO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20070102)。

1.3造模方法采用高脂飼料法加免疫損傷法高脂飼料喂養(yǎng)方法：適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，造模家兔每日給予100 g配好的高脂飼料喂養(yǎng)，相當(dāng)于每只每日給予蛋黃粉15 g，膽固醇0.5 g，豬油5 g。空白組繼續(xù)給予普通飲食，自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)8 w。實(shí)驗(yàn)中每日觀察動(dòng)物進(jìn)食和行為變化，定期稱體重。免疫損傷法〔3〕：造模動(dòng)物分別在給予高脂飼料的第1天和第20天，按0.2 g/kg體重注射牛血清白蛋白各一次。牛血清白蛋白以消毒生理鹽水配成濃度為10%溶液，過濾后經(jīng)耳緣靜脈注射。

1.4給藥方法高脂飼料喂養(yǎng)8 w，B超測定腹主動(dòng)脈斑塊形成后開始給藥，連續(xù)給藥8 w至第16周末。藥物劑量根據(jù)人兔體表面積折算等效比率計(jì)量表〔4〕，按60 kg成人劑量的3.36倍換算。各組用藥如下：空白組：不造模，飼喂正常顆粒飲食，10 ml生理鹽水/次，2次/d。模型組：造模成功后停高脂飲食，飼喂正常顆粒飼料，10 ml生理鹽水/次，2次/d。對(duì)照組：給予步長腦心通0.2 g·kg-1·d-1，溶于生理鹽水中，配成20 ml混濁液，10 ml/次，2次/d。治療組：給予化瘀克斑免煎劑，生藥量8.2 g·kg-1·d-1，溶于生理鹽水中，制成20 ml混懸液，10 ml/次，2次/d。動(dòng)物連續(xù)給藥8 w，服藥期間停服高脂飲食，改為普通飼料，并每7天測一次體重，調(diào)節(jié)用藥劑量。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1血清NO分別于給藥前、給藥后8 w末，耳緣靜脈取血2 ml，置于玻璃試管中，混勻，37℃溫育30 min，3 000 r/min，離心15 min，吸取上層血清，放入-80℃冰箱保存，采用硝酸還原酶法測定NO。

1.5.2血漿ET-1分別于給藥前、給藥后8 w末，兔耳緣靜脈取血2 ml，注入含10% EDTA-Na2溶液30 μl的帶塞試管中，混勻。室溫放置約1 h后離心，3 000 r/min，10 min，分離血漿，放入-80℃冰箱保存。按試劑盒說明書在γ計(jì)數(shù)測定儀上測定血漿中ET-1含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1血清NO水平變化實(shí)驗(yàn)8 w末，造模各組動(dòng)物血清NO水平明顯低于空白組(P<0.01)，而造模各組之間無明顯差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)16 w末，對(duì)照組與治療組NO水平較8 w末明顯提高，均明顯高于模型組(P<0.05，P<0.01)，且治療組NO水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.2血漿ET-1水平變化見表2。實(shí)驗(yàn)8 w末，造模各組動(dòng)物血漿ET-1水平明顯高于空白組(P<0.01)，而造模各組之間無明顯差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)16 w末，對(duì)照組與治療組ET-1水平較8 w末明顯降低，均明顯低于模型組(P<0.01)，且治療組ET-1水平低于對(duì)照組(P<0.05)。

表1　血清NO水平變化

與空白組比較:1)P<0.01；與本組8 w末時(shí)比較：2)P<0.05；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與對(duì)照組比較：5)P<0.05，下表同

表2　實(shí)驗(yàn)中血漿ET-1測定結(jié)果

3　討　論

內(nèi)皮損傷學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說、血栓形成學(xué)說和損傷反應(yīng)學(xué)說(又稱炎癥學(xué)說)等與AS形成密切相關(guān)〔5〕。在內(nèi)皮細(xì)胞損傷或高脂、吸煙等因素的刺激下，內(nèi)皮功能失調(diào)，其抑制AS作用減弱或消失，內(nèi)皮衍生舒張因子(EDRF)-NO通路的活性減弱，縮血管物質(zhì)釋放量增多；黏附分子表達(dá)促進(jìn)單核細(xì)胞聚集于血管內(nèi)膜下；生長因子增多引起血管平滑肌的增生和遷移；血小板聚集、組織因子的表達(dá)、纖溶酶原激活物抑制因子-1減少而易形成血栓，這些均促進(jìn)AS的形成。研究表明〔6〕，AS 發(fā)生時(shí)循環(huán)血中NO 的基礎(chǔ)釋放和活性減低，而ET濃度則明顯增高，這種失衡可引起粥樣硬化動(dòng)脈非對(duì)抗性收縮，導(dǎo)致冠脈痙攣和心肌梗死的發(fā)生。因此維持NO/ET的平衡，能夠保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮、抗AS的形成。

中醫(yī)典籍中并無AS的病名。根據(jù)該病的主要臨床表現(xiàn)及病理變化本病歸屬于“瘀證”、“痰證”的范疇，脾虛失運(yùn)、痰瘀互結(jié)是AS的關(guān)鍵病機(jī)，化瘀通脈，祛痰健脾為主要治療原則?；鐾}方其藥物組成丹參、黨參、天麻、薏苡仁、川芎、生山楂、郁金等。方中丹參味苦，性微寒，功擅活血祛瘀，為治瘀血阻滯之要藥。黨參甘平，益氣生津養(yǎng)血，能氣陰雙補(bǔ)，二者共為君藥，共奏活血養(yǎng)心、化瘀通脈、益氣健脾之功。天麻、薏苡仁共為臣藥，化瘀血、通血脈、開竅、袪風(fēng)消痰，健脾除濕。川芎、山楂行氣活血、化瘀通脈，祛痰散結(jié)，共為佐藥，助君藥以增強(qiáng)化瘀通脈、祛痰健脾之功。郁金為使藥，攜諸藥入血透絡(luò)、通達(dá)氣血。諸藥合用，標(biāo)本兼治，共奏化瘀通脈、祛痰健脾之功效。正切中了慢性腦供血不足之痰瘀互結(jié)脈中、脾氣虧虛的病機(jī)。本研究結(jié)果顯示，化瘀通脈方可能通過調(diào)節(jié)NO/ET-1平衡而達(dá)到抗AS作用。

1戴瑞鴻，李勇，范維虎，等.保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能在防治心血管疾病中的重要作用〔J〕.國際心血管雜志，2000；2(4)：328.

2陳奇，施杞.中藥藥效研究思路與方法〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：185.

3陳小野.實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)〔M〕.北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，1993：321.

4陳奇，王建華.中藥藥理研究方法學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：33.

5林兆耋，戴自英.實(shí)用內(nèi)科學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：1088-9.

6Lerman A，Burbett JC.Intact and altered endotheliumin regulation of va-somotion〔J〕.Circulation，1992；86(6)：12.

〔2015-02-24修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

山東中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011-192;2005-081)

李長生(1949-)，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腦病研究。

楊曉妮(1979-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腦病研究。

R277.7

A

1005-9202(2016)16-3908-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.017

1山東中醫(yī)藥大學(xué)