腺病毒adv-hmepe質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染表達優(yōu)化

張慧明　魏　巍　劉　爽

(佳木斯大學，黑龍江　佳木斯　154002)

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腺病毒adv-hmepe質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染表達優(yōu)化

張慧明魏巍劉爽

(佳木斯大學，黑龍江佳木斯154002)

目的構(gòu)建人細胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(hmepe)基因的重組腺病毒pYr-ads-4-hMEPE真核表達載體，并優(yōu)化其轉(zhuǎn)染條件。方法構(gòu)建腺病毒包裝質(zhì)粒pYr-ads-4-hMEPE，在HEK293細胞中包裝形成腺病毒顆粒，轉(zhuǎn)染前列腺上皮細胞株RWPE1，同時轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒作為對照細胞株。設置腺病毒重組質(zhì)粒梯度檢測最佳轉(zhuǎn)染濃度，免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染細胞株中MEPE蛋白表達水平，確定轉(zhuǎn)染效果。共聚焦顯微鏡檢測不同條件下的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果經(jīng)酶切與測序驗證，pYr-ads-4-hMEPE重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，免疫印跡分析驗證轉(zhuǎn)染rAd-4-hMEPE的RWPE1細胞株中MEPE蛋白表達水平上調(diào)，而轉(zhuǎn)染相應空載體的細胞株中MEPE蛋白的表達水平與野生型細胞株一致，說明腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功可在真核細胞表達，共聚焦檢測分析質(zhì)粒濃度對轉(zhuǎn)染效率可信度較好。結(jié)論成功構(gòu)建hmepe真核表達載體，重組腺病毒轉(zhuǎn)染RWPE1細胞最佳融合比例1.25∶1 000，即質(zhì)粒量為1.25 μl加入1 ml培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)染效率最佳。

腺病毒；轉(zhuǎn)染；優(yōu)化

病毒載體作為基因治療技術(shù)的手段被廣泛應用〔1〕，通過對病毒基因組的改造，使之能夠攜帶外源目的基因和相關(guān)的病毒元件，并被包裝成病毒顆粒。病毒轉(zhuǎn)染宿主細胞，使攜帶的外源基因在宿主體內(nèi)表達〔2〕，其中腺病毒質(zhì)粒是常用的真核表達載體。腺病毒不會將外源基因插入目的基因組，雖不能長期穩(wěn)定表達，只能瞬時轉(zhuǎn)染，但操作安全性優(yōu)于慢病毒，因此廣泛應用于實驗研究。通常腺病毒轉(zhuǎn)染效率較高并可以轉(zhuǎn)染任何細胞株，但實際應用中需要優(yōu)化條件，以達到最佳轉(zhuǎn)染結(jié)果且減少病毒使用量，增加安全性〔3〕。本實驗構(gòu)建了腺病毒人細胞外基質(zhì)磷酸糖蛋白(hmepe)真核表達質(zhì)粒，并研究其最佳轉(zhuǎn)染條件，為研究MEPE在前列腺癌細胞中的功能奠定實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料前列腺上皮細胞RWPE1、人胚腎細胞NHK293購自中國科學院上海細胞所；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞實驗室保存；表達克隆載體pYr-adshuttle-4以及Adenovirus Expression System重組腺病毒構(gòu)建體系均購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司；PCR酶、限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；T4 DNA Ligase購自NEB公司；Marker Ⅳ購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，普瑞麥格生物技術(shù)有限公司自產(chǎn)；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)；引物合成、測序均在上海英駿生物技術(shù)有限公司完成；細胞培養(yǎng)常用材料與耗材等。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建pYr-ads-4-hMEPE質(zhì)粒本實驗室保存人MEPE蛋白的cDNA序列質(zhì)粒，PCR擴增。上游引物PRIMER1：GTG AAT AAA GAA TAT AGT ATC AGT；下游引物PRIMER2：CTA GTC ACC ATC GCT CTC ACT。PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 1 min 40 s，72℃ 7 min，30個循環(huán)。膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒pYr-adshuttle-4載體和插入片段hmepe分別用NheⅠ、HindⅢ雙酶切。酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，選1～2陽性克隆酶切測序鑒定。

1.2.2構(gòu)建腺病毒質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細胞取pYr-ads-4-mMEPE 3 μl、pAd/PL-DEST(0.25 μg/μl)0.5 μl、LR Clonase Ⅱ 2 μl，25℃，1 h。加入蛋白酶K 1 μl，37℃，15 min得重組腺病毒質(zhì)粒。用PacⅠ酶切重組腺病毒質(zhì)粒，37℃水浴反應3 h。酶切后產(chǎn)物中加70 μl TE緩沖液(pH 8.0)及100 μl酚、氯仿、異戊醇的混合物，混勻。15 000 r/min離心5 min，取上清至干凈的1.5 ml EP管中。加入3 mol/L乙酸鈉(NaOAc) 10 μl，混勻，加入350 μl 無水乙醇，混勻。-80℃冷凍15 min，15 000 r/min離心15 min。70%酒精洗滌2遍，用10 μl H2O充分溶解。使用 METAFECTENETM(Biontex公司) lipid，將DNA與lipid融合，對指數(shù)生長期HEK 293細胞進行轉(zhuǎn)染。24 h后，換培養(yǎng)基為10%胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染3 d，每天觀察細胞病態(tài)反應(CPE)，>50%細胞脫壁時即收細胞進行裂解收病毒。測定病毒滴度為TCID50=10-4.2/100 μl 病毒。

1.2.3病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞鑒定取指數(shù)生長期細胞RWPE1接種于6孔培養(yǎng)板中，分別鋪3個復孔，37℃培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)染腺病毒質(zhì)粒，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入無血清培養(yǎng)基病毒顆粒混合液，1 ml無血清培養(yǎng)基中分別加入0.5、1.25、2.5、3.75、5 μl病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6 h后換為正常培養(yǎng)基，24 h后得到轉(zhuǎn)染的細胞，4%多聚甲醛固定，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，激光共聚焦顯微鏡觀察。隨機選取10個視野，每個視野下確定DAPI染色的細胞總數(shù)，然后確定MEPE高表達的激發(fā)綠色熒光的細胞數(shù)。計算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染率=綠色熒光細胞(個)/藍色細胞核(個)×100%。

1.2.4免疫印跡檢測MEPE蛋白在轉(zhuǎn)染細胞株中表達情況取指數(shù)生長期RWPE1細胞，按1.2.3步驟操作，種板、轉(zhuǎn)染，離心收集細胞，裂解細胞抽提蛋白。然后加入等體積的2×上樣緩沖液，煮沸10 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，電泳轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶封閉1 h，一抗室溫結(jié)合1 h，洗膜后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫結(jié)合1 h，洗膜后加增強化學發(fā)光法(ECL)顯色液作用3 min，壓片顯影。

2　結(jié)　果

2.1經(jīng)酶切與測序驗證pYr-ads-4-mMEPE重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，載體7 015 bp,目的片段1 575 bp。見圖1。

2.2腺病毒重組質(zhì)粒與細胞液的比例對轉(zhuǎn)染率的影響不同質(zhì)粒的量分別加入1 ml細胞培養(yǎng)液中，隨著加入質(zhì)粒量的升高，轉(zhuǎn)染率逐漸增大，1.25 μl時轉(zhuǎn)染效率最佳，增加病毒量轉(zhuǎn)染率無明顯變化；但達到5 μl時細胞大量死亡。見圖2，表1。

圖1　酶切驗證質(zhì)粒構(gòu)建pYr-ads-4-mMEPE瓊脂糖電泳圖

圖2　共聚焦檢測腺病毒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率

2.3免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染rAd-4-hMEPE的RWPE1細胞株蛋白表達水平轉(zhuǎn)染相應空載體的細胞株中MEPE蛋白表達水平與野生型細胞株一致，說明腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功并可在真核細胞表達。隨著質(zhì)粒量的不同，轉(zhuǎn)染效率不同；質(zhì)粒0.5 μl時轉(zhuǎn)染率較低，1.25 μl時較高，隨后增加質(zhì)粒的量轉(zhuǎn)染效率無顯著性差異。成功構(gòu)建hmepe真核表達載體，重組質(zhì)粒的量為1.25 μl時轉(zhuǎn)化率最佳。見圖3。

圖3　Western印跡檢測各個細胞株中MEPE蛋白表達趨勢

表1　不同腺病毒重組質(zhì)粒量對細胞轉(zhuǎn)染效率的影響±s)

3　討　論

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，是男性發(fā)病率較高的癌癥之一〔4〕。前列腺癌發(fā)病隱匿，早期易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，給診斷與根治帶來困難，患者常以骨轉(zhuǎn)移癥狀為首次就診原因。MEPE蛋白作為分泌蛋白分布在細胞外基質(zhì)中，含有多個磷酸化位點，具有類胰島素因子的活性〔5〕，與成骨性骨轉(zhuǎn)移有關(guān)，但因轉(zhuǎn)染表達效率低影響對MEPE蛋白功能的研究。

腺病毒載體的特點是宿主范圍廣，對人致病性低，在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因，能有效進行增殖，滴度高，可以通過不同的途徑感染所有細胞類型，不整合到染色體中，無插入致突變性，不會影響目的基因的長期表達，能在懸浮培養(yǎng)液中擴增，相對穩(wěn)定易于濃縮與純化，能同時表達多個基因，這些優(yōu)勢使腺病毒成為外源基因轉(zhuǎn)染機體細胞的表達載體，廣泛應用于各種基因治療。但是，作為載體腺病毒還有許多不足之處，細胞會產(chǎn)生免疫性反應，使重復感染失效〔6〕；另外，其毒性較大，用作轉(zhuǎn)染細胞實驗時需要對其毒性進行檢測〔7〕。

本實驗在RWPE1細胞株用rAD-4-hMEPE重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染，隨著重組質(zhì)粒的提高，轉(zhuǎn)染率逐漸增大，當量為1.25 μl時轉(zhuǎn)染率最佳，隨后細胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染率下降，細胞形態(tài)發(fā)生變化?？梢娹D(zhuǎn)染質(zhì)粒量不可以過大，細胞會因毒性太大而脫落。免疫印跡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染rAd-4-hMEPE的RWPE1細胞株上調(diào)MEPE蛋白表達，生長形態(tài)良好。重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可在真核細胞內(nèi)表達，當質(zhì)粒量達到1.25 μl時轉(zhuǎn)染效率明顯增高，繼續(xù)增加質(zhì)粒量轉(zhuǎn)染效率沒有太大變化。成功構(gòu)建hmepe真核表達質(zhì)粒是研究前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的前期試驗，MEPE 表達可對惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移做出預測，為惡性腫瘤基因治療奠定基礎。而且，檢測MEPE的表達水平還可監(jiān)測腫瘤治療的預后，為腫瘤基因治療提供新的靶點。

1Wu TL，Zhou DM.Viral delivery for gene therapy against cell movement in cancer〔J〕.Adv Drug Deliv Rev，2011；63(8)：671-7.

2Miller AD.Cationic liposome systems in gene therapy〔J〕.Drugs，1998;1(5)：574-83.

3Barouch DH，Alter G,Broge T,etal.Protective efficacy of adenovirus-protein vaccines against SⅣ challenges in rhesus monkeys〔J〕.Science，2015；349(6245)：320-4.

4Arterburn D，Wellman R，Westorook ED,etal.Decision aids for benign prostatic hyperplasia and prostate cancer〔J〕.Am J Manag Care，2015；21(2)：e130-40.

5Wilmott RW，Amin RS，Perez CR，etal.Safety of adenovirus-mediated transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cDNA to the lungs of nonhuman primates〔J〕.Hum Gene Ther，1996；7(3)：301-18.

6Landin AM，Kim JW，Chaudhari N.Liposome-mediated transfection of mature taste cells(J).J Neurobiol，2005；65(1)：12-21.

7Drezner MK，Quarles LD，Mundy GR.MEPE has the properties of an osteoblastic phosphatonin and minhibin〔J〕.Bone，2004；34(2)：303-19.

〔2016-05-09修回〕

(編輯袁左鳴)

國家自然科學基金資助項目(No.31471213)；黑龍江省自然科學基金資助項目(No.D201208)；佳木斯大學科學技術(shù)重點項目(No.Sz2013-003)；佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目理科面上 (No.LM2014_002)

劉爽 (1975-)，女，博士，碩士生導師，主要從事腫瘤轉(zhuǎn)移機制研究。

張慧明(1981-)，女，碩士，主要從事腫瘤轉(zhuǎn)移機制研究。

R735.7

A

1005-9202(2016)16-3901-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.014