表皮角質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)對血管內(nèi)皮生長因子水平的影響

張　燕　王　濤　劉桂麗　李瑞靜　高順強　王文氫　程　毅

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科，河北　石家莊　050011)

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表皮角質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)對血管內(nèi)皮生長因子水平的影響

張燕王濤1劉桂麗李瑞靜高順強王文氫程毅

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科，河北石家莊050011)

目的探討人表皮角質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)對血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作用的機制。方法購制人表皮角質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用雙腔通透性測定試劑盒建立細(xì)胞共培養(yǎng)模型，應(yīng)用濃度為15 ng/ml的重組人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)121和VEGF165作為對照組。利用熒光酶標(biāo)儀測定不同時間段FITC-dextran量變化，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的改變。采用Griess法測定血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化氮(NO)的變化。結(jié)果共培養(yǎng)模型中，血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞生長良好，以連續(xù)單層形式存在；內(nèi)池中VEGF121水平在5、30 min、1、2、3、4、5、6 h顯著高于VEGF165 (P<0.05)；在0、1、5、10 min，共培養(yǎng)模型內(nèi)池中NO的含量低于VEGF121刺激組(P<0.05)，但高于VEGF165刺激組(P<0.05)。結(jié)論(1)表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF有時間依賴性，其中VEGF121含量較VEGF偏多。(2)表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌物可誘導(dǎo)NO產(chǎn)生，其能力介于VEGF121和VEGF165，因此考慮表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌物中引起NO產(chǎn)生增加的主要成分為VEGF。(3)表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌物可引起血管內(nèi)皮通透性增加，其能力介于VEGF121和VEGF165，且數(shù)值接近于VEGF121，因此考慮表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌物中VEGF121較VEGF165含量高，且VEGF121較VEGF165引起血管通透性能力強。

表皮角質(zhì)細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子

目前人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的皮膚病約有2 000余種，且多數(shù)發(fā)病機制尚不完全明了，也無理想的治療方法〔1〕。特應(yīng)性皮炎患者在急性期以紅斑、滲出為主要表現(xiàn)，其病理表現(xiàn)是真皮乳頭層毛細(xì)血管網(wǎng)擴張而產(chǎn)生的紅色斑疹，進(jìn)而持續(xù)擴張導(dǎo)致血管通透性增高而出現(xiàn)真皮浮腫，其原因考慮是該類患者表皮中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)121較VEGF165含量明顯增高所造成的〔2〕。但其具體發(fā)病機制需要進(jìn)一步的研究去闡明。

VEGF在表皮主要由角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)分泌，目前研究最多的亞型包括VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189等。特異性皮炎時，皮膚KC能夠分泌更多的VEGF，從而促進(jìn)真皮層微血管增生〔3〕。本文擬研究人表皮細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機制，進(jìn)而探討特應(yīng)性皮炎的可能發(fā)病機制。

1　對象與方法

1.1主要儀器和試劑人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人表皮角質(zhì)細(xì)胞，美國Invitrogen公司；角化細(xì)胞生長培養(yǎng)基(KGM-2)、內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(EGM-2)，美國Lonza公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料公司；重組人VEGF121和 VEGF165抗體，美國Minneapolis公司；十二水磷酸氫二鈉，天津市化學(xué)試劑廠；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Sheldon公司；倒置顯微鏡，日本Nikon公司；多功能酶標(biāo)儀(SynergyⅡ)，美國biotek公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)分別將1 ml凍存的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人表皮角質(zhì)細(xì)胞直接浸泡在37℃溫水中輕輕搖動，讓細(xì)胞充分融化。從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，采用吸管將細(xì)胞懸液吸出，向離心管中加入10倍以上的培養(yǎng)液，充分混合均勻，1 000 r/min離心5 min。去除上清液，分別加入EGM-2 及KGM培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，并將其分別接種在培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液一次，待細(xì)胞融合85%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞的密度控制在不低于5×105/ml，以免影響傳代細(xì)胞的生長。待細(xì)胞再次融合為85%后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2共培養(yǎng)模型的建立應(yīng)用雙腔通透性測定試劑盒，檢測單層血管內(nèi)皮細(xì)胞在表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌的物質(zhì)作用下通透性的變化。雙腔通透性測定試劑盒主要由內(nèi)池和外池構(gòu)成，內(nèi)池底部為多聚碳酸脂膜的培養(yǎng)碟，直徑0.8 μm，外池為普通培養(yǎng)碟。向內(nèi)池加入200 μl膠原蛋白，孵育1 h，保證溶液能完全覆蓋底部且沒有氣泡，去除膠原蛋白，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1次，將培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加入EGM-2完全培養(yǎng)液。向外池內(nèi)加入人表皮角質(zhì)細(xì)胞，并加入KGM-2完全培養(yǎng)液。將以上兩種細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)，觀察兩種細(xì)胞生長情況。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成完整的單層結(jié)構(gòu)，將內(nèi)外池組合，構(gòu)建人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的體外模型。

1.2.3實驗組與對照組設(shè)計將共培養(yǎng)模型內(nèi)池更換為EGM-2去生長因子培養(yǎng)液，外池更換為去生長因子KGM-2培養(yǎng)液。采用人重組VEGF121和VEGF165作為對照，濃度15 ng/ml。與實驗組不同之處為外池?zé)o培養(yǎng)側(cè)表皮膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)池的實驗溶液中分別加入VEGF121和VEGF165。將以上實驗組及對照組組合完成后放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。

1.2.4一氧化氮(NO)測定根據(jù)NO穩(wěn)定的最終代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽在酸性環(huán)境中與 Griess 試劑中的氨基苯碘酸等物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生鮮橙紅色產(chǎn)物，在545 nm下確定最大光吸收，顏色越深，表示NO含量越高。分別于0、1、5、10 min對內(nèi)池中NO含量進(jìn)行測定。

1.2.5觀察指標(biāo)(1)人血管內(nèi)皮細(xì)胞及表皮角質(zhì)細(xì)胞在共培養(yǎng)模型中的形態(tài)；(2)共培養(yǎng)模型內(nèi)池中VEGF121和VEGF165在5、30 min、1、2、3、4、5、6 h的水平；(3)5、30 min、1、2、3、4、5、6 h共培養(yǎng)模型中血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的變化；(4)共培養(yǎng)模型內(nèi)池中NO在0、1、5、10 min的水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1共培養(yǎng)模型中血管內(nèi)皮細(xì)胞及表皮角質(zhì)細(xì)胞生長狀態(tài)兩種細(xì)胞生長良好。形態(tài)觀察：獲得的內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞以連續(xù)單層形式存在于血管內(nèi)腔表面，形態(tài)扁平、略長、多角形為主，細(xì)胞排列比較緊密。見圖1。

2.2血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞VEGF121和VEGF165水平比較各時間段血管內(nèi)皮細(xì)胞以及表皮角質(zhì)細(xì)胞中VEGF121水平均顯著高于VEGF165(P<0.05)。見表1。

2.3共培養(yǎng)模型內(nèi)池中NO含量的檢測在0、1、5、10 min，共培養(yǎng)模型內(nèi)池中NO的含量低于VEGF121刺激組(P<0.05)，但高于VEGF165刺激組(P<0.05)。見表2。

2.4表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌物對血管內(nèi)皮通透性的影響表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌物可引起血管內(nèi)皮通透性增加，其能力介于VEGF121和VEGF165，且數(shù)值接近于VEGF121，因此考慮表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌物中VEGF121較VEGF165含量高，且VEGF121較VEGF165引起血管通透性能力強(P<0.05)。見表3。

圖1　血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察(×200)

指標(biāo)5min30min1h2h3h4h5h6hVEGF1210.785±0.0245.217±0.47311.931±0.22623.987±0.07433.787±0.77146.346±0.65056.244±0.23271.207±0.496VEGF1650.625±0.0283.603±0.1047.503±0.12315.138±0.19620.843±0.35127.234±0.29929.932±0.93046.742±0.613t/P值19.53/<0.0520.44/<0.0517.42/<0.0522.04/<0.0519.53/<0.0520.44/<0.0517.42/<0.0522.04/<0.05

表2　共培養(yǎng)模型內(nèi)池中NO含量的檢測±s)

與共培養(yǎng)組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;下表同

表3　表皮角質(zhì)細(xì)胞分泌物對血管內(nèi)皮通透性的影響±s)

3　討　論

皮膚病是一種常見的容易復(fù)發(fā)的慢性炎癥性疾病，患者發(fā)病后臨床癥狀顯著，如果不采取積極有效的治療方法，將會對患者身體健康產(chǎn)生較大影響〔4〕。微血管是皮膚組織與循環(huán)血液進(jìn)行交換的場所，組織增生超過正常血管供應(yīng)范圍時將會引起組織缺氧、抑制組織增生。文獻(xiàn)報道顯示〔5〕：血管生成屬于一種比較復(fù)雜的過程，涵蓋了血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、降解、增殖等。因此，研究表皮角質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)VEGF具有重要的意義。

VEGF具有良好的生物學(xué)特性，能增加血管通透性，對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性〔6〕。相關(guān)研究顯示〔7〕：正常人皮膚中含有較高的VEGF，能維持機體微血管密度，從而能夠保持血管的通透性。VEGF的調(diào)節(jié)相對復(fù)雜，缺氧能強烈誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)。缺氧首先誘導(dǎo)VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄，再由VEGF啟動子位點的轉(zhuǎn)錄子缺氧誘導(dǎo)因子介導(dǎo)VEGF表達(dá)。

表皮角質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞均屬于一類特殊的細(xì)胞，具備良好的生物特性，能夠在特定的環(huán)境下參與血液、組織之間的營養(yǎng)交換。同時，表皮角質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞能在血管的形成、血管動力學(xué)等方面發(fā)揮作用。通常情況下，表皮角質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞以單層、連續(xù)方式存在，形態(tài)以扁平、略長、多角形為主，細(xì)胞排列比較緊密。同時，表皮角質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間具有一定的黏附性，能緊密連接和縫隙連接。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管、血管壁的屏障，由于內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的通透性，能直接參與細(xì)胞的血液傳遞、運動調(diào)節(jié)，參與機體炎癥反應(yīng)，影響血管的發(fā)生、血管通透性和液體的平衡等〔8〕。

在皮膚病患者中，皮損區(qū)VEGF水平高于非皮損區(qū)及正常皮膚，并且患者病情越嚴(yán)重，VEGF水平越高。VEGF在特應(yīng)性皮炎患者體內(nèi)生物學(xué)特點相對活躍：(1)VEGF能夠提高血管細(xì)胞的通透性；(2)VEGF能與表皮角質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生裂解，促進(jìn)血管生成。本研究中，在不同時間段，血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞VEGF121和VEGF165水平均呈現(xiàn)上升趨勢，但是VEGF121水平上升幅度顯著高于VEGF165。

NO功能相對較多，如神經(jīng)傳導(dǎo)功能、抑制血小板聚集、松弛血管平滑肌以及細(xì)胞毒性及免疫功能，增加血管通透性，提高血管舒張壓，為機體提供血量。VEGFR-2能夠介導(dǎo)生成NO和前列腺素，使血管平滑肌得到松弛。

綜上，表皮角質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)后VEGF121和 VEGF165水平均明顯升高，可以引起血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，進(jìn)一步刺激產(chǎn)生NO。但是，VEGF121對通透性的影響明顯高于 VEGF165，具有較高的臨床應(yīng)用價值。

1蔣建華，多蘭.新疆地區(qū)維吾爾族尋常型銀屑病與HLA-DRB1 07等位基因的關(guān)聯(lián)研究〔J〕.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012；25(1)：54-7.

2Miyoshi K,Takaishi M,Nakajima K，etal.Stat3 as a therapeutic target for the treatment of psoriasis：a clinical feasibility study with STA-21，a Stat3 inhibitor〔J〕.Invest Dermatol，2011；131(1)：108-17.

3Nast A，Boehncke WH，Mrowietz U，etal.S3-Guidelines on the treatment of psoriasis vulgaris (English version).Update〔J〕.J Dtsch Dermatol Ges，2012；10(2)：S1-95.

4楊斌，鄧立歡，李秉航，等.角質(zhì)細(xì)胞生長因子及氯化鋰誘導(dǎo)毛囊干細(xì)胞定向分化中的信號通路〔J〕.中國組織工程研究，2014；18(19)：3060-8.

5Johnston A，Xing X，Guzman AM，etal.IL-1F5，-F6，-F8，and-F9：a novel IL-1 family signaling system that is active in psoriasis and promotes keratinocyte antimicrobial peptide expression〔J〕.J Immunol，2011；186( 4)：2613-22.

6劉瑞風(fēng)，尹國華，張靜，等.尋常型銀屑病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性研究〔J〕.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2010；30(3)：238.

7龍庭鳳，何黎，劉流，等.人日光性角化病角質(zhì)形成細(xì)胞的體外培養(yǎng)〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010；14(20)：3660-5.

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〔2016-03-28修回〕

(編輯袁左鳴)

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81101179)

張燕(1975-)，女，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事皮膚科基礎(chǔ)研究。

R392.12

A

1005-9202(2016)16-3885-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.007

1河北省人民醫(yī)院腎內(nèi)科