O型、A型及Asia-1型口蹄疫病毒多重RT-PCR檢測方法的建立

張彥婷，吳 楠，劉玉梅，王曉清，劉國民，陳超英

（1.金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古呼和浩特市農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

O型、A型及Asia-1型口蹄疫病毒多重RT-PCR檢測方法的建立

張彥婷1，吳 楠2，劉玉梅1，王曉清1，劉國民1，陳超英1

（1.金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古呼和浩特市農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

根據(jù)口蹄疫病毒VP1基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計4條特異性引物，通過對退火溫度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立能夠同時擴(kuò)增出O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的多重RT-PCR檢測方法。結(jié)果表明，建立的方法最低可以檢測出約含1 pg/μL的病毒樣品；該方法對豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等其他相關(guān)病毒的檢測結(jié)果均為陰性，特異性良好。建立的方法能夠?qū)谔阋逴型、A型、Asia-1型病毒準(zhǔn)確定型，可廣泛用于口蹄疫病毒3個血清型的快速檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查。

口蹄疫O型病毒；口蹄疫A型病毒；口蹄疫Asia-1型病毒；多重RT-PCR

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄動物發(fā)生的烈性傳染病，可感染70多種家養(yǎng)或野生哺乳動物，并對動物養(yǎng)殖業(yè)造成非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中豬和牛的臨床表現(xiàn)最嚴(yán)重，羊表現(xiàn)亞臨床感染。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將口蹄疫列為A類動物傳染病之首，我國農(nóng)業(yè)部也將其列為一類重大動物疫病。

口蹄疫病毒屬于小RNA病毒科，病毒含正鏈RNA基因組，編碼病毒聚蛋白。其血清型復(fù)雜多變，自20世紀(jì)20年代在法國和德國發(fā)現(xiàn)O、A、C 3個不同的血清型后，20世紀(jì)40年代和50年代Pirbright研究所又確認(rèn)了3個南非型SAT 1～3和Asia-1型共7個血清型［1］?？谔阋卟《靖餮逍蜔o交叉保護(hù)，又分很多拓?fù)湫秃突蛐停?-4］。我國口蹄疫流行由來已久，疫情復(fù)雜，近年來我國周邊的部分國家和地區(qū)連續(xù)發(fā)生口蹄疫［5］。2013年以來這些國家向OIE報告口蹄疫疫情33次，其中O型8次，A型25次。今后的防疫重點(diǎn)仍是O型和A型。Asia-1型雖然自2009年5月以來沒有臨床發(fā)病的報道，但也應(yīng)引起足夠的重視。

近年來，分子生物學(xué)在口蹄疫診斷中的應(yīng)用越來越廣泛，研究人員利用分子生物學(xué)技術(shù)建立了多種口蹄疫診斷技術(shù)。對口蹄疫病毒進(jìn)行準(zhǔn)確分型和遺傳分析，是疫苗選擇和防控措施制定的重要依據(jù)［6］。該研究旨在通過建立一種快速、靈敏度高、特異性好的區(qū)分口蹄疫病毒O型、A型、Asia-1型的RT-PCR檢測方法，為口蹄疫防控措施的制定提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒毒株與樣本 口蹄疫病毒毒株JMS（O型）、OZK （O 型）、MYA98 （O 型）、WH09 （A 型）、GDMM（A 型）、JSL（Asia-1 型），由金宇保靈生物藥品有限公司種毒室保存。豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等均來自商品試劑盒中的陽性對照。

1.2 主要試劑與設(shè)備 One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit購自TaKaRa公司，凝膠回收試劑盒購自Thermo公司。MyCycler PCR儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品，全自動凝膠成像儀購自北京原平皓生物技術(shù)公司，DXY-6C型電泳儀購自北京六一廠。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室保存的口蹄疫病毒O型、A型、Asia-1型VP1基因標(biāo)準(zhǔn)序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計3條特異性引物，O1：TCAAGCTCCACGTGTGAC，A1：AGCAAGTACTCGGCTCCT，As1：CCTGGAGGTTGCGAGTC，以 及 1條 共 用 引 物 M2：ATGTCCTCTTATCTGGTTC。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取 取病毒液200 μL于1.5 mL離心管中，加1 mL Trizol裂解液裂解10～15 min。加200 μL氯仿，靜置離心后取上清液與等量異丙醇混合，靜置離心。用75%乙醇沉淀，晾干后用20 μL DEPC水溶解，用于RT-PCR擴(kuò)增。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增 以提取的O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的RNA為模板，加入One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒試劑中，與引物O1、A1、As1、M2 進(jìn)行擴(kuò)增， 以 DEPC 水為陰性對照。 采用 25 μL 反應(yīng)體系：Enzyme Mix 1 μL，2×Buffer 12.5 μL， 模板 2 μL，4 條引物各 0.25 μL，補(bǔ)DEPC水至25μL。多次試驗(yàn)后確定擴(kuò)增條件為：95℃3 min；94 ℃20 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，膠回收片段送測序公司測序。

1.6 特異性試驗(yàn) 用1.4中介紹的方法分別提取豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒的核酸，以1.5中介紹的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以DEPC水為陰性對照，評價該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn) 對用146S方法檢測出的病毒含量為10 ng/μL左右的口蹄疫Asia-1型病毒液作10倍連續(xù)稀釋，提取每個稀釋度病毒RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR檢測。能檢出最大稀釋倍數(shù)對應(yīng)的病毒含量即為該方法最小檢出量，以此來評價該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 重復(fù)提取口蹄疫O型JMS、MYA98、OZK 株，A 型 WH09、GDMM 株，Asia-1 型JSL株病毒進(jìn)行RT-PCR檢測，觀察該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

圖1 多重RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.1 RT-PCR方法的建立 由圖1可知，口蹄疫病毒O型JMS、OZK、MYA98株分別擴(kuò)增出約200 bp大小片段，A型 WH09、GDMM株分別擴(kuò)增出約300 bp大小片段，Asia-1型JSL株擴(kuò)增出約500 bp大小片段。DEPC水陰性對照沒有擴(kuò)增出條帶。

對擴(kuò)增出的核酸片段切膠回收，送測序公司測序。結(jié)果表明，O型、A型、Asia-1型的擴(kuò)增產(chǎn)物分別是 176、284、464 bp。經(jīng)與 GenBank中已知序列進(jìn)行比較，O型MYA98株序列與GenBank中MYA/3/2000 株（Sequence ID：gb/HQ632768.1）序列的相似性為99%，A型毒株序列與GenBank中A/VN/20/2009 株（Sequence ID：gb/GQ406252.1）序列的相似性為99%，Asia-1型毒株序列與GenBank中Asia-1/HN/2006 株（Sequence ID：gb/KC412634.1）序列的相似性為99%。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 由圖2可知，以口蹄疫病毒O型JMS株、A型WH09株、Asia-1型JSL株的RNA為模板，均擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，檢測結(jié)果為陽性；以DEPC水和豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒的核酸為模板，均未擴(kuò)增出任何條帶，檢測結(jié)果為陰性。

圖2 多重RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 以蔗糖梯度離心法檢測出口蹄疫Asia-1型病毒 （JSL株）146S含量為10ng/μL的病毒液作為母液，進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋。提取不同稀釋度病毒液的RNA，以其為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。由圖3可知，第5個稀釋度（第6泳道）可以擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，即該方法最小檢出量為1 pg/μL。

圖3 多重RT-PCR敏感性試驗(yàn)電泳結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 提取口蹄疫病毒O型JMS、MYA98、OZK 株，A 型 WH09、GDMM 株，Asia-1型JSL株病毒RNA，作為模板重復(fù)進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果均擴(kuò)增出相應(yīng)大小的目的條帶，檢測結(jié)果為陽性。說明該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。

3 討論

口蹄疫一年四季均可發(fā)生，但秋冬季最為嚴(yán)重。各種家養(yǎng)和野生偶蹄動物對口蹄疫病毒均易感，引發(fā)疾病的嚴(yán)重程度因免疫程度、感染病毒量、病毒毒株和動物種類而不同，其發(fā)病的嚴(yán)重程度在同種動物的不同個體間也有差異。目前對口蹄疫還沒有特異性治療方法，仍以疫苗免疫為主?？谔阋卟《居?個血清型，各型之間均無交叉免疫性，型內(nèi)各毒株之間有明顯的抗原差異，預(yù)防口蹄疫等于預(yù)防7種病或多種病，只使用1種血清型的疫苗對其他6種血清型病毒是沒有保護(hù)作用的。因此，快速準(zhǔn)確的診斷對口蹄疫的科學(xué)防控具有指導(dǎo)意義?？焖贉?zhǔn)確地區(qū)分口蹄疫病毒的血清型，可以為疫苗的選擇和防控措施的制定提供理論依據(jù)，從而將口蹄疫危害降到最低。該研究建立的RT-PCR方法能夠在3 h內(nèi)完成對口蹄疫病毒O型、A型、Asia-1型的準(zhǔn)確分型，具有操作簡單、準(zhǔn)確性好、靈敏度高等特點(diǎn)，對口蹄疫病毒血清型的快速診斷具有重要意義，可以為疫苗的選擇及流行病學(xué)調(diào)查提供有利的技術(shù)支撐，具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］索布林那，多明戈.口蹄疫現(xiàn)狀與未來［M］.朱彩珠，張強(qiáng)，盧永干，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009.

［2］KNOWLES N J，SAMUEL A R，DAVIES P R，et al.Pandemic strain of foot-and-mouth disease virus serotype O［J］.Emerg Infect Dis，2005，11（12）：1887-1893.

［3］VALARCHER J F，KNOWLES N J，ZAKHAROV V，et al.Multiple origins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia 1 outbreaks，2003-2007 ［J］.Emerg Infect Dis，2009，15（7）：1046-1051.

［4］殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

［5］謝慶閣.口蹄疫［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

［6］SAMULE A R，KNOWLES N J.Foot-and-mouth disease type O viruses exhibit genetically and geographically distinct evolutionary lineages （topotypes） ［J］.J Gen Virol，2001，82（3）：609-621.

Establishment of a Multiplex RT-PCR for Simultaneous Detection of FMDV Serotypes O,A and Asia-1

ZHANG Yan-ting1，WU Nan2，LIU Yu-mei1，WANG Xiao-qing1，LIU Guo-min1，CHEN Chao-ying1
（1.The Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hohhot 010030，China；2.Hohhot Municipal Bureau of Agriculture and Animal Husbandry of Inner Mongolia，Hohhot 010020，China）

The aim of the present study was to develop a multiplex RT-PCR for simultaneous detection of FMDV serotypes O,A and Asia-1.Four specific primers were designed by Primer Premier 5.0 Software targeting VP1 gene of FMDV.The annealing temperature and other reaction conditions were optimized.The results showed that the detection limit of the established method was 1 pg/μL;the detection results of CSFV,PPV,PRV,PRRSV,PCV and other related virus by using the developed method was all negative,indicating the good specificity of the method.FMDV serotypes O,A and Asia-1 could be accurately discriminated by the multiplex RT-PCR method developed in this study which was suitable for rapid detection and molecular epidemiological survey of the three serotype of FMDV.

FMDV serotype O；FMDV serotype A；FMDV serotype Asia-1；multiplex RT-PCR

S854.43；S855.3

A文章順序編號：1672-5190（2016）12-0009-03

2016－11－19

張彥婷（1972—），女，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物疾病監(jiān)測工作。

劉玉梅（1978—），女，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疾病監(jiān)測工作。

（責(zé)任編輯：趙俊利）