茶多酚二甲亞砜合劑對鈾礦塵人支氣管細胞毒性的防護作用

黃波，龍穎，邱勁松，黃云，胡建安

(1.中南大學公共衛(wèi)生學院，湖南長沙410078;2.南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南衡陽421001)

茶多酚二甲亞砜合劑對鈾礦塵人支氣管細胞毒性的防護作用

黃波1，2，龍穎2，邱勁松2，黃云2，胡建安1

(1.中南大學公共衛(wèi)生學院，湖南長沙410078;2.南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南衡陽421001)

目的探討鈾礦塵所致人支氣管細胞BEAS-2B細胞DNA損傷以及茶多酚二甲亞砜合劑對細胞的防護作用。方法BEAS-2B細胞中加入鈾礦塵、鈾礦塵+茶多酚、鈾礦塵+二甲亞砜、鈾礦塵+茶多酚二甲亞砜合劑染毒24 h后，通過檢測微核和多核細胞觀察染色體損傷，彗星實驗及H2AX蛋白磷酸化檢測DNA的損傷，多核細胞法檢測細胞次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)突變。結(jié)果與正常對照組相比，BEAS-2B細胞經(jīng)鈾礦塵染毒后，細胞的微核率、多核率和拖尾率明顯升高，H2AX蛋白磷酸化表達增高，HPRT突變率明顯增高(P＜0.05)，鈾礦塵+茶多酚、鈾礦塵+二甲亞砜和鈾礦塵+茶多酚二甲亞砜合劑保護能有效降低上述變化(P＜0.05)，其中茶多酚二甲亞砜合劑的保護效果最好。結(jié)論鈾礦塵對BEAS-2B細胞DNA具有損傷作用，茶多酚二甲亞砜合劑有較強防護作用。

鈾;茶多酚;二甲亞砜;DNA損傷

鈾(uranium)礦粉塵及其氧化物可通過呼吸道及消化道進入人體形成內(nèi)輻射，從而發(fā)生輻射效應。前期研究發(fā)現(xiàn)，鈾礦塵能誘發(fā)人支氣管細胞BEAS-2B氧化損傷，二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)和茶多酚(tea polyphenol，TP)一定程度上均能降低這種損傷［1－2］。本研究通過制備TP和DMSO合劑，采用BEAS-2B細胞作為靶細胞，研究TP和DMSO合劑對鈾礦塵染毒BEAS-2B細胞的防護作用，為鈾礦塵損傷的醫(yī)學防護新藥開發(fā)提供有益的理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

BEAS-2B細胞，本實驗室保存。鈾礦塵從南華大學核工業(yè)鈾礦溶浸采礦重點實驗室(鈾的含量為4.52‰)獲得，DMSO和6-巰基鳥嘌呤(6-TG)購自Sigma公司，茶多酚從無錫太陽綠?？萍加邢薰精@得。鈾礦塵用瑪瑙研缽研磨后，經(jīng)500目篩過篩，高溫高壓消毒后用無血清培養(yǎng)液LHC-8配成5 g·L－1混懸液。

1.2 細胞分組和染毒

將指數(shù)生長期的BEAS-2B細胞分為5組:正常對照組、鈾礦塵組、TP保護組、DMSO保護組、TP+DMSO合劑保護組。鈾礦塵組細胞加入鈾礦塵1.0 g·L－1染毒;TP保護組、DMSO保護組和TP+DMSO合劑保護組先分別加入TP 250 mg·L－1，0.5%DMSO和0.5%DMSO+TP 250 mg·L－1，在37℃下孵育2 h后，再分別加入鈾礦塵1.0 g·L－1，染毒24 h。

1.3 微核多核細胞檢測

細胞染毒后，用冰冷的PBS洗凈，固定液(甲醇∶乙酸=3∶1)固定15 min，Giemsa染色后，在油鏡下觀察細胞，計數(shù)每1000個細胞中微核細胞數(shù)和多核細胞數(shù)。

1.4 中性單細胞凝膠電泳實驗

實驗分組與染毒同上，染毒24 h后，收集細胞制成懸液;取100 μl密度為1%正常熔點瓊脂糖滴至磨砂玻片上，4℃冷卻10 min;取10 μl密度為5×108L－1上述細胞懸液與60 μl低熔點的瓊脂糖混勻滴在第一層瓊脂糖上，4℃冷卻10 min;在第二層上再滴上60 μl低熔點的瓊脂糖，蓋上蓋玻片置于4℃冷卻10 min;將玻片放入4℃細胞裂解液中裂解2 h;用0.5%TBE(pH 8.2～8.5)漂洗3次，每次1 h;玻片置于中性緩沖液中，4℃電泳30 min(25 V，5 mA);PI染色15 min，Olympus熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下觀察并拍照;用CASP軟件分析彗星細胞數(shù)目。

1.5 Western印跡法檢測磷酸化H2AX(Ser139)蛋白表達

細胞染毒后，消化離心，收集細胞，加入蛋白裂解液，室溫裂解后，離心，收集蛋白。常規(guī)Western印跡檢測磷酸化H2AX(Ser139)蛋白表達水平(15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，0.22 μm NC膜)，用β肌動蛋白作為內(nèi)參。

1.6 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase，HPRT)基因突變檢測

細胞染毒后，用PBS洗凈，換新鮮的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第5代時，分為兩部分，一部分加入終濃度為6-TG 0.1 mmol·L－1的LHC-8培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)30 h;同時向兩部分加入細胞松弛素B(cytochalasin B)6 mg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)42 h;胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，固定液(甲醇∶乙酸=3∶1)固定;細胞懸液滴片，Giemsa染色，干燥后，光鏡下計數(shù)5000個細胞，記錄在同一胞漿內(nèi)具有完整核膜的雙核或多核細胞(包括相壓、相切和分離的雙核或多核細胞數(shù))。含有6-TG培養(yǎng)細胞中的1000個細胞中雙核或多核細胞數(shù)除以不含6-TG培養(yǎng)的1000個細胞中雙核或多核細胞數(shù)，所得結(jié)果為HPRT基因位點突變頻率(‰)。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 茶多酚二甲亞砜合劑對鈾礦塵致細胞微核多核發(fā)生的影響

由表1可見，與正常對照組比較，鈾礦塵1.0 g·L－1能誘發(fā)BEAS-2B細胞微核細胞數(shù)及多核細胞數(shù)增加(P＜0.05)。與鈾礦塵組相比，TP，DMSO和TP+DMSO合劑保護組對鈾礦塵誘發(fā)BEAS-2B細胞微核細胞數(shù)及多核細胞數(shù)增加有明顯的抑制作用(P＜0.05)。其中，TP+DMSO合劑保護組的抑制作用較TP保護組和DMSO保護組更為明顯(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of tea polyphenol(TP)and dimethylsulfoxide(DMSO)mixture on micronuclei increase induced by uranium dust

2.2 茶多酚二甲亞砜合劑對鈾礦塵致細胞拖尾數(shù)增多的抑制作用

由表2可見，與正常對照組相比，在彗星實驗中，可見鈾礦塵誘發(fā)BEAS-2B細胞拖尾數(shù)和尾部DNA含量明顯增加，彗星尾長明顯延長(P＜0.05)，表明鈾礦塵對BEAS-2B細胞DNA具有明顯的損傷作用。與鈾礦塵組相比較，TP，DMSO和TP+DMSO合劑保護組對鈾礦塵誘發(fā)的細胞DNA的損傷具有明顯的抑制作用(P＜0.05)。TP+DMSO合劑保護組的抑制作用較TP保護組和DMSO保護組更為明顯(P＜0.05)。

2.3 茶多酚二甲亞砜合劑對磷酸化H2AX蛋白表達的影響

由圖1可見，而H2AX(Ser139)蛋白表達條帶中，鈾礦塵組灰度最高;TP，DMSO和TP+DMSO合劑保護組條帶灰度均低于鈾礦塵組，其中以TP+DMSO合劑保護組灰度最低。表明鈾礦塵能誘發(fā)BEAS-2B細胞H2AX(Ser139)磷酸化增加，具有較強的損傷DNA能力;而TP，DMSO和TP+DMSO合劑保護組能有效減少H2AX(Ser139)磷酸化，具有抑制DNA損傷的能力，其中TP+DMSO合劑保護組的保護作用最強。

Tab.2 Effect of TP and DMSO mixture on increased number of tailing cells induced by uranium dust

Fig.1 Effect of TP and DMSO mixture on phospho-histone H2AX increased expression induced by uranium dust by Western blotting.Lane 1:normal control;lane 2:uranium+TP+DMSO;lane 3:uranium+DMSO;lane 4:uranium+TP;lane 5:uranium.B was the seniquantitative result of A.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with uranium group.

2.4 茶多酚二甲亞砜合劑對HPRT基因突變的影響

表3結(jié)果表明，與正常對照組相比，鈾礦塵組可引起細胞HPRT基因突變率顯著增高(P＜0.05);與鈾礦塵組相比，TP，DMSO，TP+DMSO合劑保護組可抑制鈾礦塵引起的突變率增高(P＜0.05)。

Tab.3 Effect of TP and DMSO mixture on uranium dustinduced hypoxanthine phosphoribosyltransferase(HPRT)gene mutation rate

3 討論

鈾礦粉塵可使鈾礦工肺癌高發(fā)［3－4］，但其致癌機制尚未明了。由于鈾礦塵的接觸人群多，影響長遠，因此鈾礦塵的毒性機制研究及相關(guān)醫(yī)學防護制劑的研制是亟待解決的問題。

本研究發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B細胞經(jīng)鈾礦塵染毒后與正常對照組比較細胞的微核率、多核率和拖尾率升高，H2AX蛋白磷酸化表達增高，HPRT突變率增高，3個保護組能有效降低上述變化，其中TP+DMSO合劑保護組的保護效果最好。說明TP+DMSO合劑對鈾礦塵引起的DNA和染色體損傷具有較強的保護作用。

眾多研究表明，HPRT基因突變與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，HPRT基因的突變廣泛存在于環(huán)境中，基因重組是引起腫瘤發(fā)生的重要機制。細胞DNA錯配修復(mismatch repair)系統(tǒng)功能缺陷的人類腫瘤細胞自發(fā)HPRT突變頻率比功能正常的腫瘤細胞高50～750倍［5－6］。

γ-H2AX的形成是一個快速敏感的細胞反應，當環(huán)境和代謝等因素使細胞和動物體內(nèi)的染色質(zhì)DNA發(fā)生雙鏈斷裂時，SQ基序的139位絲氨酸殘基快速發(fā)生磷酸化形成γ-H2AX。因此，可以根據(jù)γ-H2AX的表達高低來判斷細胞DNA受損的情況［7－8］。

TP是從綠茶中提取的多酚類化合物，具有強大的清除自由基和抗氧化性能，生物學作用廣泛［9－10］。加入TP后對鈾礦塵誘發(fā)BEAS-2B細胞內(nèi)外活性氧的增高具有明顯抑制作用，乳酸脫氫酶的外溢也大大減少，從而有效地抑制了遺傳毒性。

DMSO是優(yōu)良的雙親性強的極性有機溶劑，作為自由基清除劑和輻射損傷保護劑的應用研究頗受關(guān)注。Huang等［11］發(fā)現(xiàn)，其對鈾礦塵誘發(fā)BEAS-2B細胞內(nèi)外活性氧增高、DNA損傷和體外轉(zhuǎn)化有明顯抑制作用。DMSO對鈾礦塵作用于BEAS-2B細胞后，可引起細胞DNA的斷裂，造成細胞拖尾率、彗星尾部DNA含量、尾長、尾部面積和尾距增加具有較好的抑制作用［1］。

由于體內(nèi)的自由基反應是鏈式反應，利用復合式抗氧化劑抑制自由基對生物體的損傷已成為國內(nèi)外新的研究熱點。具有不同的活性、存在形式、作用位點、相對分子質(zhì)量大小和脂水溶解性質(zhì)的抗氧化劑或自由基清除劑之間有相互替代補充和協(xié)同增強作用。在本研究中也發(fā)現(xiàn)TP+DMSO合劑的防護效果最好。

［1］Li SZ，Huang B，Huang R，He XP.The protection of DMSO to cytotoxic of human bronchial epithelial cell caused by uranium mine dust［J］.China Med Eng(中國醫(yī)學工程)，2008，16(1):26-28，31.

［2］Huang B，Long Y，Luo ZH，Huang R，He XP.Protective effects of tea polyphenols on oxidative damage induced by uranium-mineral dust in BEAS-2B cells［J］.Chin J Public Health(中國公共衛(wèi)生)，2011，27(3):284-286.

［3］Gulson BL，Mizon KJ，Dickson BL，Korsch MJ.The effect of exposure to employees from mining and milling operations in a uranium mine on lead isotopes－a pilot study［J］.Sci Total Environ，2005，339(1-3):267-272.

［4］Wen JA，Jiang RY，Chang XQ，Zhong R，Gu JJ，Wang WA，et al.Study on mortality of a cohort of miners in a Chinese uranium mine during 1958－1997［J］.Radiat Protection(輻射防護)，2002，22(1):44-50.

［5］Ao L，Liu SX，Yang MS，F(xiàn)ong CC，An H，Cao J.Acrylamide-induced molecular mutation spectra at HPRT locus in human promyelocytic leukaemia HL-60 and NB4 cell lines［J］.Mutagenesis，2008，23(4):309-315.

［6］Havla JB，Hill CE，Abdel-Rahman SZ，Richter E.Evaluation of the mutagenic effects of myosmine in human lymphocytes using the HPRT gene mutation assay［J］.Food Chem Toxicol，2009，47(1):237-241.

［7］Kuo LJ，Yang LX.Gamma-H2AX-a novel biomarker for DNA double-strand breaks［J］.In Vivo，2008，22(3):305-309.

［8］Ewald B，Sampath D，Plunkett W.H2AX phosphorylation marks gemcitabine-induced stalled replication forks and their collapse upon S-phase checkpoint abrogation［J］.Mol Cancer Ther，2007，6(4):1239-1248.

［9］Thangapazham RL，Singh AK，Sharma A，Warren J，Gaddipati JP，Maheshwari RK.Green tea polyphenols and its constituent epigallocatechin gallate inhibits proliferation of human breast cancer cells in vitro and in vivo［J］.Cancer Lett，2007，245(1-2):232-241.

［10］Yamada H，Watanabe H.Tea polyphenols in preventing cardiovascular diseases［J］.Cardiovasc Res，2007，73(2):439-440.

［11］Huang B，Chen F，Yang ZH，Pan XJ，Cao ZS，Zhu MX.Oxidative damage of BEAS-2B cells induced by depleted uranium and protection by DMSO［J］.Chin J Radiol Med Prot(中華放射醫(yī)學與防護雜志)，2009，29(2):143-146.

Protection of tea polyphenol and DMSO mixture against uranium dust-induced cytotoxicity in human bronchial epithelial cells

HUANG Bo1，2，LONG Ying2，QU Jin-song2，HUANG Yun2，HU Jian-an1
(1.College of Public Health，Central South University，Changsha410078，China;2.College of Public Health，University of South China，Hengyang，421001，China)

OBJECTIVETo observe the uranium dust-induced DNA damage in BEAS-2B cells and the protective effect of tea polyphenol(TP)and DMSO mixture.METHODSUranium dust，uranium+TP，uranium+DMSO，uranium+TP+DMSO were added into BEAS-2B cells for 24 h.Chromosomal damage was observed by micronucleus and multinuclear cells，DNA damage by comets assay，and expression of H2AX phosphorylated proteins and hypoxanthine phosporibosyltransferase(HPRT)gene mutations were assayed by multinucleated cell method.RESULTSCompared with normal control group，the micronucleus rate，multinuclear rate，tailing rate，expression of H2AX protein phosphorylation and HPRT gene mutation rate in BEAS-2B cells were significantly increased(P＜0.05)after BEAS-2B cells were exposed to uranium dust.Uranium+TP，uranium+DMSO and uranium+TP+DMSO effectively reduced the changes(P＜0.05).Uranium+TP+DMSO mixture had the best protective effect.CONCLUSIONUranium dust can cause DNA damage in BEAS-2B cells.TP and DMSO mixture has a stronger protective effect.

uranium;tea polyphenol;dimethyl sulfoxide;DNA damage

The project supported by National Natural Science Foundation of China(81072331);and Hunan Provincial Department of Education Research Fund(07C619)

HU Jian-an，E-mail:jiananhu@xysm.net，Tel:(0731)84805460

R965.3

A

1000-3002(2012)04-0546-04

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.04.014

國家自然科學基金(81072331)，湖南省教育廳科研基金(07C619)

黃波(1974－)，博士研究生，副教授，主要從事環(huán)境化學致癌及其醫(yī)學防護研究;胡建安(1955－)，博士，教授，博士生導師，主要從事環(huán)境化學物毒性作用研究。

胡建安，E-mail:jiananhu@xysm.net，Tel:(0731)84805460

2011-11-29接受日期:2012-03-21)

(本文編輯:付良青)