運(yùn)動(dòng)員腸道乳桿菌分離株對小鼠免疫功能的增強(qiáng)作用

劉志剛，馮海峰

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)體育與藝術(shù)學(xué)院，山東泰安271018

運(yùn)動(dòng)員腸道乳桿菌分離株對小鼠免疫功能的增強(qiáng)作用

劉志剛，馮海峰*

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)體育與藝術(shù)學(xué)院，山東泰安271018

為研究運(yùn)動(dòng)員腸道乳桿菌分離株對小鼠免疫功能的影響，本試驗(yàn)用4周齡小白鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，將清潔級昆明小鼠（雌性）300只隨機(jī)分為5組（I～V），I組口服嗜酸乳桿菌，II組口服卷曲乳桿菌，III組口服鼠李糖乳桿菌，IV組口服唾液乳桿菌，濃度均為（1×1010cfu/mL），V組為對照組（不口服乳桿菌），每組10 mL/d，連續(xù)灌喂14 d，分別于口服乳桿菌后第3、7、14、21、28、35、42 d進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和唾液乳桿菌均能提高小鼠血清抗體效價(jià)、小腸內(nèi)IgA含量、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率以及血清中IL-2含量，尤其以嗜酸乳桿菌效果最佳。結(jié)果證明了從運(yùn)動(dòng)員新鮮糞樣中分離到的優(yōu)勢乳桿菌能顯著提高機(jī)體的體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平，初步闡明了運(yùn)動(dòng)性胃腸綜合征的發(fā)病機(jī)制及運(yùn)動(dòng)員服用微生態(tài)制劑提升運(yùn)動(dòng)素質(zhì)的機(jī)理。

運(yùn)動(dòng)員；腸道；乳桿菌；免疫功能

隨著微生物生態(tài)學(xué)研究的深入，證實(shí)定植在人和動(dòng)物機(jī)體胃腸道內(nèi)微生物菌群區(qū)系主要是由許多細(xì)菌組成，它們附著在腸內(nèi)粘膜上，參與了機(jī)體的食物消化、藥物代謝、合成維生素和防止外源致病菌入侵腸道，對于維持機(jī)體健康和實(shí)現(xiàn)各種生理功能起著非常重要的作用，人體腸道內(nèi)這些微生物與人體胃腸的功能關(guān)系密切［1］。

運(yùn)動(dòng)性胃腸綜合征是運(yùn)動(dòng)員常出現(xiàn)的一種訓(xùn)練綜合征，是在高強(qiáng)度、大運(yùn)動(dòng)量的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和比賽中造成的機(jī)體胃腸功能紊亂的現(xiàn)象，而且也不同程度地妨礙了運(yùn)動(dòng)員正常的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和比賽［2，3］。前期對抽取的山東農(nóng)大運(yùn)動(dòng)員腸道的正常菌群進(jìn)行分離鑒定，對定植在胃腸道內(nèi)的正常微生物區(qū)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)員腸道中的優(yōu)勢菌群為嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）、卷曲乳桿菌（L.crispatus）、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）和唾液乳桿菌（L.salivarius）［4］。

乳酸桿菌是應(yīng)用最早、應(yīng)用歷史最長的微生物添加劑，也是機(jī)體腸道的優(yōu)勢菌群之一，眾多研究表明它具有改善機(jī)體代謝、促進(jìn)腸道有益菌增殖、抑制有害菌生長和增強(qiáng)機(jī)體免疫等作用。采用優(yōu)勢菌群研制的微生態(tài)制劑口服液，運(yùn)動(dòng)員服用10 d后胃腸功能、運(yùn)動(dòng)持久力、抗感冒的能力均明顯增強(qiáng)，能更好地適應(yīng)運(yùn)動(dòng)帶來的應(yīng)急反應(yīng)，抗疲勞能力增強(qiáng)0.7～1.1 h［4］，為了驗(yàn)證其中的機(jī)理，本試驗(yàn)以小白鼠為動(dòng)物模型，將不同種類的乳桿菌給小白鼠口服來研究其免疫功能增強(qiáng)作用，為進(jìn)一步闡明運(yùn)動(dòng)性胃腸綜合征的發(fā)病機(jī)制及提升運(yùn)動(dòng)員素質(zhì)的機(jī)理提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

嗜酸乳桿菌SL-1株，為從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)高水平運(yùn)動(dòng)員糞樣中分離到的菌株［4］；小白鼠為清潔級昆明小鼠，購自山東泰邦公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2試劑

胎牛血清，鄭州佰安生物工程有限公司產(chǎn)品，批號(hào)201511003；羊抗鼠酶標(biāo)二抗，購自晶美生物工程有限公司；鼠淋巴細(xì)胞分離液，購自上海浩本生物科技有限公司；伴刀豆素球蛋白（ConA），Amresco公司產(chǎn)品，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液配制成0.025 mg·mL-1，過濾除菌，分裝，-20℃保存；120370胃蛋白酶1：3 000Amresco分裝，活力單位3 000～3 500 U/mg；RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品；PI染料，Amresco公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒，IL-2檢測試劑盒，SIgA檢測試劑盒，均購自上海浩本生物科技有限公司。

1.3儀器

分光光度計(jì)，UV-1100型，上海美普達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，PE-6800VET型，深圳普康電子有限公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，Guava Technologies公司產(chǎn)品，型號(hào)GuagaEasyCyte Mini；Gene5酶標(biāo)儀，ELX800型，美國Bio-Tek寶特公司生產(chǎn)。

1.4小鼠動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)和檢測指標(biāo)

選取2周齡清潔級昆明小鼠（雌性）300只，放于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周，然后隨機(jī)分為4組（I～V），每組60只。試驗(yàn)分組：I組口服嗜酸乳桿菌，II組口服卷曲乳桿菌，III組口服鼠李糖乳桿菌，IV組口服唾液乳桿菌，濃度均為（1×1010cfu/mL）；V組為對照組（不口服乳桿菌）。每組10 mL/d，連續(xù)灌喂14 d，在第3 d，每組均注射NDV疫苗。分別于免疫后第3、7、14、21、28、35、42 d對小鼠進(jìn)行心臟采血，頸椎脫臼處死后取小腸，然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.4.1抗體水平的檢測將每組血液樣本離心（2000 r/min，10 min），分離出血清。采用ELISA試劑盒檢測血清中NDV-IgG含量。

1.4.2小腸內(nèi)SIgA的檢測對各組小鼠截取20 cm十二指腸至空腸段的小腸，加2 mL PBS充分研磨，離心取上清，用作一抗。按照SIgA ELISA試劑盒說明書步驟操作，測定OD 450 nm值。

1.4.3淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的檢測無菌采取小鼠心臟抗凝血2 mL，沿試管壁緩緩加入含有2 mL鼠淋巴細(xì)胞分離液的試管中，1500 r/min離心20 min；吸取淋巴細(xì)胞層移入無菌離心管中，用RPM I 1640離心洗滌淋巴細(xì)胞3次（2000 r/min，15 min）；用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活率＞95%，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用RPM I 1640（含10%犢牛血清）調(diào)細(xì)胞濃度至1.0×108個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，隨后加入ConA（終濃度25 μg/mL），同時(shí)設(shè)不加ConA的對照孔，置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。然后每孔加入5 mg/mL MTT10 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，每孔再加DMSO 100 μL，于小型微量振蕩器上輕輕振蕩混勻約15 min，溶解各孔中沉淀物；于酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長下各孔的OD值，按下式計(jì)算：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（%）=（試驗(yàn)孔平均OD值-對照孔平均OD值）/試驗(yàn)孔平均OD值×100%。

1.4.4細(xì)胞因子IL-2的檢測按照小鼠IL-2ELISA試劑盒說明書要求檢測血清中IL-2的含量。

1.4.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以X±SD表示，用SPSS 11.0軟件進(jìn)行Duncan多重比較分析。

2　結(jié)果

2.1小鼠血清抗體效價(jià)的變化

由表1可知，免疫后3 d，小鼠的抗體效價(jià)開始發(fā)生變化，嗜酸乳桿菌I組和鼠李糖乳桿菌III組在第21 d達(dá)到抗體高峰，而卷曲乳桿菌II組、唾液乳桿菌IV組和對照組V組在第28 d達(dá)到抗體高峰；從免疫后第7 d，口服各種乳桿菌試驗(yàn)組I～I(xiàn)V組抗體滴度顯著高于對照組V組（P＜0.05），嗜酸乳桿菌I組、卷曲乳桿菌II組和鼠李糖乳桿菌III組顯著高于唾液乳桿菌IV組（P＜0.05）；免疫后7 d至第42 d，鼠李糖乳桿菌III組抗體水平高于卷曲乳桿菌II組，但差異不顯著。

表1　小鼠血清抗體效價(jià)Table 1 The serum antibody titer in NDV immune enhanced mice

2.2小鼠小腸內(nèi)IgA含量的變化

表2　小鼠小腸內(nèi)IgA含量的變化Table 2 The change of SIgA in the intestine of mice

由表2可見，從免疫后第3 d，小白鼠小腸內(nèi)IgA含量開始變化，各個(gè)組均在21 d到達(dá)高峰值；嗜酸乳桿菌I組、卷曲乳桿菌II組、鼠李糖乳桿菌III組和唾液乳桿菌IV組均顯著高于對照組（V組）（P＜0.05）；I組IgA含量總體水平顯著高于II～I(xiàn)V組（P＜0.05），并且I～I(xiàn)V組IgA含量均高于下一組。

2.3小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的變化

表3　小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的變化Table 3 The transformation ratio of lymphocyte in mice

由表3可見，從免疫后第7 d，小白鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率嗜酸乳桿菌I組、卷曲乳桿菌II組、鼠李糖乳桿菌III組和唾液乳桿菌IV組均顯著高于對照組（V組）（P＜0.05），各個(gè)組均在28 d到達(dá)高峰值；I組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于II～I(xiàn)V組（P＜0.05）；II～I(xiàn)V組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率差異不顯著。

2.4小鼠血清IL-2含量的變化

表4　小鼠血清IL-2含量的變化Table 4 The change of IL-2 in mice（ng/L）

由表4可見，免疫后3 d小鼠血清IL-2含量開始發(fā)生變化，從免疫后第7 d，小鼠血清IL-2含量嗜酸乳桿菌I組、卷曲乳桿菌II組、鼠李糖乳桿菌III組和唾液乳桿菌IV組均顯著高于對照組（V組）（P＜0.05），各個(gè)組均在21 d到達(dá)高峰值；I組小鼠血清IL-2含量顯著高于II～I(xiàn)V組（P＜0.05）；II～I(xiàn)V組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率差異不顯著。

3　討論

（1）人體的胃腸道是控制和調(diào)節(jié)適應(yīng)和再生能力系統(tǒng)的一部分，平衡的胃腸免疫系統(tǒng)以及積極的免疫活性可以使運(yùn)動(dòng)員抵御有害病原體的侵害。在運(yùn)動(dòng)過程中，機(jī)體所發(fā)生的一系列的變化將會(huì)導(dǎo)致胃腸系統(tǒng)的功能及其結(jié)構(gòu)的變化，降低胃腸道對體液及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致脫水和能量貯存不足，從而影響運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)能力［5，6］。近年來，隨著高校高水平運(yùn)動(dòng)員的增多，鍛煉項(xiàng)目及鍛煉強(qiáng)度的增加，運(yùn)動(dòng)員常常出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后身體不適，尤其是胃腸功能的問題［1］。胃腸微生物區(qū)系對維持運(yùn)動(dòng)員健康起著重要作用，而且與胃腸綜合征的發(fā)病有著一定的聯(lián)系［2，3］。本研究利用從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)高水平運(yùn)動(dòng)員新鮮糞樣中分離到的嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和唾液乳桿菌對小白鼠的免疫功能的影響研究，進(jìn)一步揭示了高水平運(yùn)動(dòng)員胃腸道微生物區(qū)系與人體素質(zhì)（免疫功能）的關(guān)系，為提高運(yùn)動(dòng)員的抵抗力、增強(qiáng)體質(zhì)提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

（2）本試驗(yàn)選用4周齡小白鼠作為動(dòng)物模型，小白鼠體型小，性情溫順，易于飼養(yǎng)管理、操作和觀察，對外來刺激和病原體均很敏感，此外，由于遺傳均一，個(gè)體差異小，試驗(yàn)結(jié)果精確可靠，均有利于試驗(yàn)研究。抗體效價(jià)的水平能直接反映機(jī)體體液免疫的狀態(tài)；sIgA是黏膜免疫應(yīng)答過程中的主要體液因子，腸道中SIgA含量的變化直接反映機(jī)體黏膜的局部免疫狀態(tài)［7］；細(xì)胞免疫不僅參與胞內(nèi)的免疫應(yīng)答而且對體液免疫也有一定的調(diào)節(jié)作用，是抗感染免疫的主要力量；白細(xì)胞介素2（IL-2）主要由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，是所有T細(xì)胞亞群的生長因子，并可促進(jìn)活化B細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，增強(qiáng)單核細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞（NK）的殺傷活性，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)作用［8，9］；T淋巴細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫功能的承擔(dān)者，它分泌各種介質(zhì)并作用于其他淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，行使信息傳遞、識(shí)別、效應(yīng)等功能，是機(jī)體免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞［10-12］。試驗(yàn)結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和唾液乳桿菌均能提高小鼠血清抗體效價(jià)、小腸內(nèi)IgA含量、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率以及血清中IL-2含量。結(jié)果充分證明了從運(yùn)動(dòng)員新鮮糞樣中分離到的優(yōu)勢乳桿菌能顯著提高機(jī)體的體液免疫水平和細(xì)胞免疫水平。

（3）前期研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)大學(xué)運(yùn)動(dòng)員口服微生態(tài)制劑后明顯增強(qiáng)了運(yùn)動(dòng)員的抗應(yīng)急、抗疲勞、抗感冒的能力，堅(jiān)持服用微生態(tài)制劑可以明顯提高運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)能力。本次研究以小白鼠為動(dòng)物模型，將不同種類的乳桿菌給小白鼠口服來研究其免疫功能增強(qiáng)作用，進(jìn)一步闡明了運(yùn)動(dòng)性胃腸綜合征的發(fā)病機(jī)制及運(yùn)動(dòng)員服用微生態(tài)制劑提升運(yùn)動(dòng)素質(zhì)的機(jī)理。

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［4］劉志剛，馮海峰，莊俊濤，等.農(nóng)業(yè)院校高水平運(yùn)動(dòng)員腸道菌群區(qū)系與身體素質(zhì)的關(guān)系探討［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015，46（6）：874-879

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The Effect of Lactobacillus Isolated from the Athletes on the Immune Function of Mice

LIU Zhi-gang，F(xiàn)ENG Hai-feng*
College of Sports and Art/Shandong Agricultural University，Taian 271018，China

In order to study the effect of Lactobacillus isolated from the athletes on the immune function of mice，female Kunming mice（4 weeks old）used in all experiments were divided into 5 groups（I～V）.The group I was immunized via oral with strain of Lactobacillus acidophilus；the group II was immunized via oral with strain of Lactobacillus crispatus；the group III was immunized via oral with strain of Lactobacillus rhamnosus；the group IV was immunized via oral with strain of Lactobacillus salivarius.All groups with the concentration of 1×1010cfu/mL.The group V was control group（Lactobacillus without oral administration）and the bacterial fluid was given by average（10 mL）for 14 days.The relevant indicators were detected after oral administration of Lactobacillus in 3，7，14，21，28，35 and 42 d.Test results showed that Lactobacillus acidophilus，Lactobacillus crispatus，Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus saliva could improve the serum antibody titer of mice，IgA content in small intestine，lymphocyte transformation rate and serum IL-2 content，especially with the best effect of Lactobacillus acidophilus.The Lactobacillus isolated from the fresh fecal samples could significantly improve the humoral and cellular immunity.The study preliminary clarified the pathogenesis of sports gastrointestinal syndrome and the mechanism of the athletes taking the micro ecological agents.

Athletes；intestinal；Lactobacillus；immune function

R378.2

A

1000-2324（2016）02-0177-04

2015-02-11

2015-05-01

山東星火計(jì)劃項(xiàng)目

劉志剛（1958-），男，副教授.研究方向?yàn)樽闱蜻\(yùn)動(dòng)及陽光體育運(yùn)動(dòng).E-mail：zhigang5807@sina.com

*同等貢獻(xiàn)作者：馮海峰（1962-），女，副教授.研究方向?yàn)樾∏蝾愡\(yùn)動(dòng).