腦科學研究新技術*

杜久林　畢國強　駱清銘　徐富強　方 英　王 琛1 中國科學院上海生命科學研究院神經(jīng)科學研究所 上海 2000312 中國科學技術大學 合肥 2300263 華中科學技術大學 武漢 4300744 中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所 武漢 4300715 國家納米研究中心 北京 1001906 中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心 上海 200031

腦科學研究新技術*

杜久林1，6**畢國強2，6駱清銘3，6徐富強4，6方 英5，6王 琛5，6
1 中國科學院上海生命科學研究院神經(jīng)科學研究所 上海 200031
2 中國科學技術大學 合肥 230026
3 華中科學技術大學 武漢 430074
4 中國科學院武漢物理與數(shù)學研究所 武漢 430071
5 國家納米研究中心 北京 100190
6 中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心 上海 200031

文章針對目前腦科學的發(fā)展需求，就亟需研發(fā)的幾個關鍵技術方向——“神經(jīng)信號新型檢測技術”“新型顯微成像技術”“神經(jīng)環(huán)路形態(tài)追蹤和功能操控技術”和“全腦尺度上神經(jīng)環(huán)路重構技術”進行闡述。希望通過國家大型腦科學研究計劃的頂層設計，集全國之力量，推動我國腦科學核心技術的研發(fā)，為腦科學和交叉科學的發(fā)展作出貢獻，并打破高端科研儀器長期為歐美壟斷的局面。

電極陣列，光學成像，跨突觸神經(jīng)環(huán)路示蹤，光遺傳學，神經(jīng)環(huán)路重構

腦科學研究的關鍵是要實現(xiàn)對神經(jīng)元集群活動的實時觀察，并通過特定神經(jīng)環(huán)路的結構追蹤及其活動操縱，研究其對腦功能的充分性和必要性，進而在全腦尺度上解析神經(jīng)環(huán)路的結構和功能。目前通用的神經(jīng)電活動觀測方法是單通道或多通道微電極。這些方法所能記錄到的神經(jīng)元數(shù)量有限，且無法觀察到閾下電位的變化。因而，需要從新材料使用、微小化、光電融合、記錄與刺激融合等方向著手，研制新型神經(jīng)電極陣列。除了用電極直接記錄神經(jīng)電信號，近年來熒光成像方法也被廣為使用，如在神經(jīng)元內(nèi)表達對鈣離子敏感的熒光蛋白分子，通過檢測因電活動而產(chǎn)生的鈣離子濃度的變化來描述電活動。這種光學測量法的優(yōu)點是可同時觀測數(shù)百個神經(jīng)元的電活動，缺點是時間分辨率低（約10-1s）。因此，神經(jīng)科學界目前高度期望能開發(fā)出新一代對細胞膜電位變化敏感、有高信噪比、能分辨單個動作電位（毫秒級）的熒光分子或納米粒子探針，可以特異性地標記各種類型的神經(jīng)元，從而實現(xiàn)高時空分辨率、大范圍神經(jīng)元集群電活動的同時檢測。同時，神經(jīng)元功能及其電活動的產(chǎn)生依賴于精細的亞細胞結構，因此需要研發(fā)新一代超高分辨率光學顯微技術，在活細胞甚至活體動物上觀察神經(jīng)元的精細結構。近年來發(fā)展起來了病毒介導的神經(jīng)環(huán)路示蹤技術和光遺傳學技術，前者可以標記特定的神經(jīng)元類型和所在的神經(jīng)環(huán)路，后者則可以通過光來控制特定的神經(jīng)元的活動。為了研究控制特定神經(jīng)環(huán)路的功能，需要將這兩種技術有機結合，研發(fā)標記和操控多種神經(jīng)環(huán)路的新工具。在上述基礎之上，需要研發(fā)全腦尺度上的高通量重構技術，在全腦尺度上重現(xiàn)大腦多個神經(jīng)環(huán)路的投射結構和精細聯(lián)結。下面，逐一闡述上述關鍵技術的國際現(xiàn)狀和未來需求。

1 神經(jīng)信號的新型檢測技術

如何實現(xiàn)高時空分辨率、大范圍的神經(jīng)信號檢測是目前神經(jīng)科學研究的主要技術瓶頸之一。針對這個關鍵技術問題，有兩種解決方案：（1）植入式神經(jīng)電極，通過神經(jīng)元動作電位引起電極的電流變化從而實現(xiàn)信號的記錄。（2）電壓敏感分子和納米熒光探針，通過動作電位引起分子和納米粒子熒光信號變化而實現(xiàn)信號的記錄。

1.1新型神經(jīng)電極的設計與應用

金屬電極陣列（MEA）是目前商用程度較高的植入式神經(jīng)電極。然而，金屬電極技術具有較低的空間分辨率與生物相容性差等問題。金屬電極的熱噪聲隨著器件尺寸的降低而增大，從而制約了其空間分辨率的提高；金屬電極與生物組織有著較大的力學差異，使得電極難以實現(xiàn)與腦組織的良好接觸，同時易于引起生物體的排異反應，最終導致電極的失效。納米材料和納米技術為發(fā)展新型的神經(jīng)電極技術提供了重要機遇。

（1）提高了神經(jīng)電極的空間分辨率?；趫鲂w管器件的神經(jīng)電極能夠?qū)崿F(xiàn)對神經(jīng)信號的原位放大，對提高神經(jīng)檢測的信噪比有著重要的意義。例如，石墨烯作為一種二維半導體納米材料，具有高的載流子遷移率、力學強度以及化學穩(wěn)定性。基于石墨烯晶體管器件的神經(jīng)電極陣列有望實現(xiàn)對神經(jīng)信號的高空間分辨率檢測［1］。另外，利用石墨烯的高透明度，可以實現(xiàn)對神經(jīng)組織電信號與光信號的同時采集，從而大大提高神經(jīng)分析的可靠性。

（2）提高了神經(jīng)電極的生物相容性及長效穩(wěn)定性。通過發(fā)展超薄的柔性網(wǎng)狀神經(jīng)電極，可實現(xiàn)與腦組織的力學性能相匹配［2］。這種柔性網(wǎng)狀電極可以通過針管注射的方式導入到小鼠的腦組織中。5 周后，超薄柔性網(wǎng)狀電極與神經(jīng)元形成了穩(wěn)定的接觸界面，并且不會引起小鼠的免疫排斥反應，為實現(xiàn)對神經(jīng)信息的長期穩(wěn)定檢測奠定了基礎（圖 1a）。

1.2新型電壓敏感探針的設計與應用

1.2.1電壓敏感分子熒光探針

從 20 世紀 80 年代末，科學家就已開始開發(fā)檢測電壓變化的染料和探針。最早開發(fā)的是有機熒光染料，其動力學響應較快，但靈敏度低，且普遍具有很強的光毒性，因此無法在活體動物中進行長時間的成像。其后，眾多實驗室開發(fā)出了不同版本的遺傳編碼電壓指示探針（GEVIs），這些電壓探針可分為 3 種，部分已可應用于活體動物，如線蟲、果蠅、斑馬魚、哺乳類動物等。（1）是將離子通道對電壓敏感的區(qū)域與熒光蛋白相連，形成一個嵌和蛋白，當細胞膜電壓發(fā)生改變時，蛋白構象發(fā)生變化，從而導致相連熒光蛋白的發(fā)射光增強或減弱；這類蛋白本底熒光強，但是其動力學響應較慢（10 毫秒），且反應較小。（2）是近年來開發(fā)的基于視紫紅質(zhì)的探針，視紫紅質(zhì)的吸收譜和發(fā)射譜對電壓非常敏感，當細胞去極化，熒光蛋白的發(fā)射光就會減弱，指征電壓變化；其特點是動力學響應快，反應大，但其熒光量子效率比綠色熒光蛋白（GFP）低 2—3 個數(shù)量級，所以需要更高強度的照明光進行成像。斯坦福大學 Mark Schnitzer 實驗室最新開發(fā)的電壓敏感熒光蛋白就是基于這一原理，響應速度能達到 0.4 ms；并且其結合一個很亮的熒光蛋白，極大地降低了照明光的光強，因此可在活體果蠅及小鼠中檢測單個動作電位的發(fā)放［3］。（3）可稱為混合式電壓探針，是將電壓敏感有機分子與熒光蛋白相結合；當細胞膜電位發(fā)生變化時，帶電荷的有機分子會在細胞膜中移動，從而導致相連的熒光蛋白產(chǎn)生熒光共振能量轉移效應，改變其熒光亮度［4］。

1.2.2新型電壓敏感納米熒光探針

相對于熒光分子，量子點（Quantum Dot， QD）的熒光強度較高，電壓響應較快，并且在光照下有著更好的穩(wěn)定性。由于其具有其他材料無可比擬的光、聲、磁、電、熱等特殊性能，QD 在神經(jīng)科學領域已得到成功應用。例如，借助于量子限制斯塔克效應，QD 可感應神經(jīng)元單個動作電位［5］。相比于分子或蛋白類電壓敏感探針，QD 具有更好的光穩(wěn)定性。功能納米顆粒在神經(jīng)活動遠程控制中的作用也日益凸顯。近期，研究人員借助于超順磁性納米顆粒 Fe3O4在交變磁場下產(chǎn)生的熱效應，使神經(jīng)元中對熱敏感的 TRPV1 通道開放，從而達到遠程控制大腦神經(jīng)活動的目的［6］。這種方法不僅對活體組織無害，且不受穿透深度限制。目前，中科院神經(jīng)科學所正開發(fā)基于上轉換發(fā)光納米顆粒（Upconversion Nanoparticles，UCNPs）的電壓敏感探針。其獨特優(yōu)勢在于 UCNPs 可用活體穿透深度較高的近紅外光（980 nm）激發(fā)。初步研究結果證實，所設計的納米探針可感應細胞膜電位變化，發(fā)光變化幅度明顯優(yōu)于目前任何一種分子或蛋白類電壓敏感探針?？梢灶A見未來神經(jīng)科學家和材料學家的交叉合作有望取得突破。

目前，QD 對電壓敏感性的研究尚處于初期，其毒性制約了在活體動物上的應用。為此，一方面亟需提高QD 對神經(jīng)電位的檢測靈敏度。通過將電壓敏感結構域與熒光蛋白或化學共價熒光標記蛋白相融合，可以構建遺傳編碼電壓敏感分子探針，實現(xiàn)高靈敏和大動態(tài)范圍的檢測。此外，QD 理論研究表明，動作電位的產(chǎn)生可以引起單一種類半導體 QD（ZnS，CdTe 等）5% 熒光強度的變化以及 1 nm 波長的變化。而采用兩種 QD 復合構成的神經(jīng)探針，熒光強度更是可以在動作電位下發(fā)生 30% 的變化（圖 1b）。另一方面，通過結合對神經(jīng)元類型特異膜受體有親和性的蛋白或多肽，可以實現(xiàn)選擇性的神經(jīng)元標記，從而有利于提高檢測的電壓靈敏度和特異性。另外還需要克服 QD 的細胞毒性問題。蛋白包被同樣是解決這一問題的有效手段。此外，許多科研人員也在嘗試采用其他無毒的無機 QD（碳量子點等）。兼顧檢測性能與生物相容性的熒光檢測無疑是今后的重點研究方向之一。

電壓指示探針靈敏度相對較低，對檢測設備要求非常高，這也阻礙了其廣泛使用。此外，絕大多數(shù)探針都是用可見光激發(fā)，無法檢測深層組織的電壓變化。因此，使用紅外光激發(fā)或者其他材料檢測電壓變化尤為關鍵，我們最新開發(fā)的基于上轉換材料 UCNP 的新型電壓探針，其能被 980 nm 激光激發(fā)，發(fā)射可見光；且具有較好的動力學響應速度，光毒性也大大降低，因此 UCNP 材料用于電壓成像可能是一個很好的選擇。

圖1　 可注射的網(wǎng)狀神經(jīng)電極（a）和半導體量子點檢測動作電位的機理（b）

2 新型顯微成像技術

正如人們常說的“眼見為實”，從17 世紀英國博物學家羅伯特·胡克通過他自己制作的顯微鏡發(fā)現(xiàn)“細胞”開始，顯微成像技術在現(xiàn)代生物學的發(fā)展中就一直起著至關重要的推動作用。19 世紀末西班牙病理學家圣地亞哥·拉蒙-卡哈爾通過在顯微鏡下對大量腦組織樣品的細致觀察，提出了“神經(jīng)元學說”，奠定了現(xiàn)代神經(jīng)生物學的基礎。20 世紀中期開始，借助電子顯微鏡，人們可以觀測到神經(jīng)細胞之間突觸聯(lián)結的精細結構，從而理解神經(jīng)信息傳遞的化學本質(zhì)；同時借助包括共聚焦、雙光子成像等各種熒光顯微成像技術，人們開始研究大腦組織中大量神經(jīng)元如何相互連接形成神經(jīng)環(huán)路。而進入 21世紀以來，最新顯微成像技術的發(fā)展以及其與信息計算技術的融合，產(chǎn)生了包括超高分辨率光學顯微和冷凍電鏡成像等超微納米成像技術以及包括光片照明顯微等可用于活體神經(jīng)網(wǎng)絡活動研究的高速體成像方法，突破了傳統(tǒng)技術在空間和時間分辨率的極限。基于這些仍在快速發(fā)展中的新技術手段，神經(jīng)生物學家對大腦的觀測進入了從突觸到全腦，跨越多個尺度的“聯(lián)結組學”時代。

2.1前沿電子顯微技術

神經(jīng)突觸一般只有不到 1μm3大小，卻是大腦神經(jīng)環(huán)路聯(lián)結體系的基本計算單元，執(zhí)行信息傳遞加工等關鍵功能，其可塑性變化是學習、記憶等各種高級腦功能的物質(zhì)基礎，而其結構功能異常則是抑郁癥、精神分裂癥、老年性癡呆等各種精神、神經(jīng)疾病的根源。因此，對突觸內(nèi)部超微結構的解析是理解突觸乃至神經(jīng)環(huán)路功能與疾病機制的關鍵所在。幾十年來，電子顯微鏡以其納米水平的分辨率一直是這一微觀尺度研究的重要工具。而最近幾年來，最新的冷凍電子顯微技術，包括電鏡三維斷層成像及單顆粒三維重構，通過結合快速冷凍對樣品的保存和高性能計算突破了常規(guī)電子顯微鏡的局限，可以對亞細胞超微結構乃至蛋白質(zhì)大分子復合物進行極高分辨率的解析。美國加州大學洛杉磯分校周正洪、舊金山分校程亦凡等華人科學家均是這一領域的先驅(qū)。利用單顆粒三維重構，清華大學等單位率先解析了與老年性癡呆相關的神經(jīng)突觸蛋白 γ 分泌酶復合物的原子分辨率三維結構。利用冷凍電鏡斷層成像技術結合自主研制的光學-電子關聯(lián)顯微裝置和算法，中國科學技術大學等單位首先解析了完整的神經(jīng)突觸在接近生理狀態(tài)下的高分辨三維超微結構，可以直接觀測到特定種類突觸上單個蛋白分子復合物的形態(tài)和準確定位（圖 2）。這些方法的進一步發(fā)展，可望實現(xiàn)對神經(jīng)突觸的“終極”定量解析與表征。

圖2　神經(jīng)突觸的冷凍電鏡三維斷層重構

在百微米尺度上，近幾年發(fā)展高通量掃描電子顯微技術成為了解析由多個神經(jīng)元聯(lián)結構成的神經(jīng)微環(huán)路的重要工具。通過不同方式的連續(xù)切片和電子掃描成像，德國馬普研究所和美國哈佛大學等單位先后實現(xiàn)了對小鼠視網(wǎng)膜中以及腦皮層中微環(huán)路的完整解析。這種針對大腦神經(jīng)環(huán)路進行反向工程的微環(huán)路解析除了自動超薄切片與電鏡成像的硬件技術外，對電鏡圖像的分析、識別和三維重建也極具挑戰(zhàn)。中科院自動化所等單位在這一領域已經(jīng)具有很好的積累，目前也在與中國科學技術大學等單位合作發(fā)展光電關聯(lián)環(huán)路重建技術。

2.2超高分辨光學顯微技術

與電子顯微技術相比，光學顯微特別是熒光顯微方法具有更高的靈敏度和特異性，從而可用于解析特定分子組成的表達與分布以及特定細胞或亞細胞結構的識別與分類，同時光學顯微可以用于活細胞成像，這些優(yōu)點對有效解析神經(jīng)突觸和環(huán)路的結構功能至關重要。但一般情況下，光學顯微受衍射極限的限制，只能達到亞微米級（數(shù)百納米）的分辨率，這顯然不足以清楚解析同樣亞微米尺度的神經(jīng)突觸內(nèi)部細微結構及其病理變化。最新發(fā)展的超微光學成像技術利用受激輻射耗盡（STED）以及單分子定位重構（PALM/STORM）等方法突破了光學衍射的限制，達到了數(shù)十納米的分辨率，美國科學家埃里克·白茲格和威廉·莫爾納以及德國科學家斯蒂芬·黑爾等為此獲得 2014 年諾貝爾獎化學獎。美國華人科學家莊小威也是這一領域的先驅(qū)者，并首先將此技術應用于神經(jīng)突觸的超微結構以及對單個神經(jīng)元輸入聯(lián)結組的完全解析。

我國科學家也在超高分辨光學成像技術方面開展了創(chuàng)新性工作，中國科學技術大學、中科院生物物理所、北京大學等單位研發(fā)了超高分辨光學成像的分子探針，實現(xiàn)了亞細胞區(qū)室與細胞器的活細胞動態(tài)超微成像，并利用 STORM 技術解析了神經(jīng)突觸的不同類型。這一技術在組織樣品尺度方面有進一步發(fā)展，通過與電子顯微技術和計算技術的結合，有可能成為下一代神經(jīng)環(huán)路反向工程的新的突破口，也是中科院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心和中科院腦功能聯(lián)結圖譜先導專項中技術研究團隊的一個重要方向。

2.3寬場照明成像技術

腦功能往往涉及全腦范圍內(nèi)大量神經(jīng)元的協(xié)同運作，探究其機制需要快速大規(guī)模的神經(jīng)活動記錄。光學成像方法結合能夠報告神經(jīng)元活動水平的熒光染料和蛋白，可以同時觀察成百上千個神經(jīng)元，在過去 10 多年中取得了若干重要成果。然而，受逐點采集的原理限制，通行的雙光子成像和共聚焦成像每秒只能采集數(shù)幀，遠不足以觀察精細的神經(jīng)活動，更難以研究三維空間中的集群活動。近來發(fā)展的光片照明成像技術，同時激發(fā)整個成像平面的熒光蛋白，又具有良好的軸向分辨率，結合靈敏的熒光相機，可以實現(xiàn) 100 Hz 的神經(jīng)活動成像，再輔以軸向掃描則可記錄三維神經(jīng)元集群的活動［7］。光場成像技術采用傳統(tǒng)照明激發(fā)三維空間內(nèi)的熒光分子，通過微小透鏡陣列和數(shù)據(jù)重建分離不同深度的熒光信息，從而同步采集三維空間中的神經(jīng)元活動。這些寬場成像方法尤其適于研究小巧透明的實驗對象，如斑馬魚幼魚。斑馬魚具有與高等脊椎動物類似的神經(jīng)系統(tǒng)，在1周齡已表現(xiàn)出多種復雜行為，但其大腦相對較小，通過透明的皮膚可清楚分辨其中的數(shù)十萬個神經(jīng)元，從而實現(xiàn)全腦尺度上神經(jīng)元活動的光學記錄，同時也可以釋放其眼睛或尾部來觀察感覺刺激所引起的運動。此外，作為重要的模式動物，斑馬魚適合各種遺傳學操作，使得可以編輯特定基因及其表達，標記特定的神經(jīng)元類型和集群，藉此在行為過程中監(jiān)測記錄全腦神經(jīng)元的活動，通過光遺傳學方法操縱參與特定功能的神經(jīng)元集群的活動并標記其形態(tài)和聯(lián)系特征，實現(xiàn)神經(jīng)活動記錄、操縱與精細結構成像的有機結合，從而實現(xiàn)解析整個神經(jīng)系統(tǒng)工作原理（圖3）［8］。

圖3　斑馬魚全腦神經(jīng)元活動檢測和操控技術示意圖

3 神經(jīng)環(huán)路追蹤和光遺傳學

神經(jīng)環(huán)路的復雜性是由神經(jīng)細胞種類的復雜、不同種類神經(jīng)細胞電生理特征的復雜和不同腦區(qū)的不同種類神經(jīng)細胞連接模式的復雜決定的。因此，如果希望在細胞層次上研究和認識腦功能，就必須結合分子標記和示蹤、細胞操縱和干擾等方法、針對特定細胞給予標記。光遺傳學神經(jīng)調(diào)控技術是整合了光學、基因工程、電生理以及電子工程的一種全新的多學科交叉的生物技術。其主要原理是首先采用基因技術將光感基因轉入到神經(jīng)系統(tǒng)中特定類型的細胞中進行表達，使其在細胞膜上形成特殊的離子通道。這些離子通道在不同波長的光照刺激下達到對細胞選擇性地興奮或者抑制的目的，從而可以對特定細胞類型的神經(jīng)通路進行毫秒級精準的開啟或者關閉。嗜神經(jīng)病毒是神經(jīng)環(huán)路結構和功能研究中的新生力量，具有以下特點和優(yōu)勢：種類繁多；可以跨突觸傳播；跨突觸方向可控，可特異順行或逆行傳播；病毒跨突觸后可復制，信號不衰減；可攜帶多種標示物；可結合已有的數(shù)百種 cre- 動物品系，對特定類型細胞的神經(jīng)環(huán)路進行高靈敏的可視化。

光遺傳學技術在短短 10 年已經(jīng)成為了神經(jīng)環(huán)路解析最重要的技術，被廣泛應用到神經(jīng)科學研究之中，同時因為此技術的高時空精準、細胞特異性的優(yōu)勢，可應用此技術針對疾病的研究，包括失明、焦慮、癱瘓等，國外已經(jīng)逐步在向臨床應用轉化的方向推動。此方面技術的瓶頸主要是可能應用到人體的整體技術的優(yōu)化和商業(yè)開發(fā)。其次，作為一種在實驗室中重要的生物技術，目前針對腦科學的研究已經(jīng)不可或缺，但是，應用此技術展開腦功能解析的綜合研究儀器，例如整合光遺傳、電生理技術、光學成像和大腦磁共振的儀器設備等至今沒有商業(yè)產(chǎn)品，許多都依賴實驗室自己的搭建，大多只能滿足單一的實驗需求。因此，基于光遺傳技術、細胞分辨、高時空精準神經(jīng)環(huán)路功能調(diào)控的整套實驗技術、裝置和設備的革新可以預期將伴隨著高質(zhì)量的研究成果和對產(chǎn)業(yè)的推動。載體病毒的感染和傳播機制不清，限制新系統(tǒng)的設計；毒力普遍需弱化，方可廣泛用于長期跟蹤研究；侵入位點、傳播方向和跨突觸級數(shù)等的可控性有待提高以獲得更特異的結構信息；結構示蹤與功能研究的兼容性和確定執(zhí)行特定功能的環(huán)路方面尚無工具化的示蹤體系；對缺乏 cre- 品系的眾多物種包括大鼠、樹鼩和非人靈長類缺乏細胞類型特異的標記手段。

目前國際上常用于神經(jīng)環(huán)路示蹤系統(tǒng)，主要是可分為3大類：（1）皰疹病毒科的偽狂犬病毒和單純皰疹病毒；（2）彈狀病毒科的狂犬病毒和水皰炎病毒；（3）限制跨突觸病毒感染和傳播范圍的輔助病毒，包括腺相關病毒、逆轉錄病毒和慢病毒等。基于這些病毒的結構、感染及復制特性，利用反向遺傳學及同源重組等手段，篩選和改造病毒，減弱毒力，插入熒光蛋白等外源基因，初步滿足逆向跨單突觸和多突觸、正向跨多突觸傳播的示蹤系統(tǒng)，成為神經(jīng)環(huán)路研究的有力工具。我國對神經(jīng)環(huán)路示蹤技術的研究于 2008 年始自中科院武漢物理與數(shù)學所，早期的跟蹤性研究獲得了國際權威 L. Enquist 和 E. Callaway 的無私支持，2012 年之后在自然科學基金委“情感與記憶神經(jīng)環(huán)路”和中科院戰(zhàn)略先導“腦功能聯(lián)結圖譜”等專項及科技部“973”計劃的支持下，建立了國際上幾乎所有具有使用價值的體系，發(fā)展了在靈敏度、標識物和宿主多樣性、穩(wěn)定性、安全性、病毒毒力等方面更優(yōu)越的 100 多種新型示蹤系統(tǒng)（圖 4），并為國內(nèi)外科研院所廣泛應用［9，10］。但大多數(shù)所建立的，包括結構與功能研究兼顧的體系，與大多文獻報道類似，尚需相當努力使之工具化。

光遺傳學技術在國內(nèi)近幾年的發(fā)展得到了包括自然科學基金委、科技部以及中科院一些項目的支持。但是，相比美國等國家針對此技術方向的支持力度，差距巨大。國內(nèi)團隊在光刺激多通道電生理記錄技術、光遺傳學單細胞水平調(diào)控技術研發(fā)以及應用此技術解析特定神經(jīng)環(huán)路功能等方面取得了一些重要的進展。依托中科院深圳先進技術院已經(jīng)建立了功能完善的光遺傳技術研發(fā)、應用和技術資源共享平臺，基于國內(nèi)平臺的研發(fā)工作，擁有自主知識產(chǎn)權的光遺傳及其相關技術已經(jīng)獲批 30 余件核心專利；同時此技術體系由中科院深圳先進技術院輻射到境內(nèi)外 230 余家實驗室，在短期內(nèi)極大地整體上提升了國內(nèi)科研機構在國際此領域的競爭力。

目前，需針對性地加強所涉及病毒與宿主相互作用的機理研究，從而設計出極弱毒力的、侵入位點、傳播方向和跨突觸級數(shù)可控的、高靈敏和靈活的、適于不同物種（尤其是非人靈長類）、兼顧結構示蹤與功能研究的、細胞和突觸類別特異的、可標識執(zhí)行特定功能的、不依賴于 cre- 品系的神經(jīng)環(huán)路示蹤工具庫。強化標記體系的工具化和工業(yè)化，建立全國性支撐服務平臺，全面推動腦科學的發(fā)展。目前國內(nèi)光遺傳學相關技術與國際同領域技術基本保持同步。光遺傳技術和多種腦功能解析技術的整合，例如電生理、腦功能成像、光學成像等，需要整合國內(nèi)優(yōu)勢團隊協(xié)同攻關。國外至今也尚無此類研究手段。建議基于國內(nèi)已經(jīng)獲得自主知識產(chǎn)權的核心技術，拓展應用，并充分利用國內(nèi)學科交叉、協(xié)同攻關的工作模式：（1）研發(fā)基于光遺傳技術的腦功能解析手段和科研裝置；（2）運用此技術，針對我國已經(jīng)取得進展的研究領域，例如本能行為神經(jīng)環(huán)路功能解析、精神疾病的病理性神經(jīng)環(huán)路解析、特定腦功能圖譜的解析等；（3）是光遺傳技術的科研產(chǎn)業(yè)化推動以及針對疾病治療的臨床前研究、技術儲備等，為未來可能的臨床應用奠定基礎。

圖4　活體腦細胞和神經(jīng)環(huán)路的病毒標記示例

4 神經(jīng)環(huán)路重構

人腦中有約 1011個分子類型特異的神經(jīng)元，它們通過約 1014個突觸彼此相互交織形成神經(jīng)信息傳遞、處理和整合的立體神經(jīng)環(huán)路。解析神經(jīng)環(huán)路的結構與功能是闡明高級腦功能機理的前提和基礎，這需要首先明確構成環(huán)路的神經(jīng)元類型以及在單神經(jīng)元水平構建跨腦區(qū)的環(huán)路結構。國際科學界高度重視神經(jīng)環(huán)路結構的構建，2013年美國發(fā)起了“創(chuàng)新性神經(jīng)技術推動的腦研究”，并將確定神經(jīng)細胞類型和建立大腦精細結構圖作為前兩項重點研究的內(nèi)容，而其他研究均需要以這兩項為基礎，這充分顯示出在介觀層面解析神經(jīng)環(huán)路之于腦研究的重要性和迫切性。

近年來，借助于小鼠的轉基因技術、神經(jīng)標記技術迅猛發(fā)展，為構建小鼠腦神經(jīng)環(huán)路及繪制連接圖譜提供了豐富的動物模型資源。面向小鼠的全腦光學顯微成像技術也應運而生，它們突破光學成像深度限制，足以獲取厘米見方的神經(jīng)環(huán)路結構信息［11］。其中，由華中科技大學自主研發(fā)的顯微光學切片斷層成像（Micro-Optical Sectioning Tomography， MOST）系列技術［11，12］，在國際上首次獲得了體素分辨率為 1 μm 的小鼠全腦連續(xù)三維結構數(shù)據(jù)集，并首次展示了小鼠全腦內(nèi)長距離軸突投射通路的連續(xù)追蹤（圖 5）。正是基于上述技術領域的進步，美國 Allen 腦科學研究所已經(jīng)重建出一套體素分辨率 100 μm 的腦區(qū)水平的小鼠腦連接圖譜，但還未達到單神經(jīng)元分辨水平。

盡管鼠腦研究方興未艾，但為了更有效地揭示人類腦疾病發(fā)生發(fā)展過程，理解人腦高級功能機制，開展與人類親緣關系更密切的非人靈長類動物腦研究的重要性日益凸顯。我國在非人靈長類的神經(jīng)環(huán)路研究中具有得天獨厚的優(yōu)勢，擁有豐富的非人靈長類動物資源，中科院腦科學和智能技術卓越中心已經(jīng)在全國建立了多個非人靈長類腦功能的研究平臺，獼猴轉基因技術亦處于國際領先。相比之下，歐美國家受到了資源、倫理、政策等因素的制約，相關研究日益衰退。我國有望抓住這一歷史機遇，在非人靈長類神經(jīng)環(huán)路研究方面取得突破，在腦科學競爭的國際舞臺搶占先機。但是，獼猴的腦容量約為小鼠腦的 90 倍，研究難度遠大于小鼠腦。為了構建非人靈長類大腦神經(jīng)環(huán)路，需要在樣本標記與制備、大樣本高分辨率成像技術、大數(shù)據(jù)處理與分析等方面進行系統(tǒng)性、多學科的協(xié)同攻關，才有望取得突破。

與鼠腦研究相比，高質(zhì)量的非人靈長類動物模型還十分匱乏。不僅是因為靈長類動物繁育周期長，在小鼠等低等動物中已十分成熟的分子遺傳學方法、實驗手段，大多難以直接、甚至完全不能應用于非人靈長類等高等模式動物。而且，在大體積腦組織中熒光標記物（如病毒）和包埋固定物質(zhì)如何能快速均勻滲透，如何提高樣本質(zhì)量的穩(wěn)定性和持久性等都是亟待解決的技術難題。

如何建立單細胞分辨的非人靈長類動物全腦數(shù)據(jù)獲取的光學顯微成像技術是又一大技術難題?，F(xiàn)有技術以0.5 μm3精度掃描完整小鼠腦大約需要 3—10 天，若對靈長類全腦范圍進行成像則需數(shù)月時間，時間成本巨大，無法滿足生物學統(tǒng)計性的樣本量需求。而且，現(xiàn)有成像儀器、關鍵器件難以勝任連續(xù)數(shù)月的工作強度。因此，需要從成像原理、核心器件、采集策略上求得突破，開發(fā)出高通量、高精度，適用于非人靈長類大腦的下一代全腦成像技術。

解決了獲取數(shù)據(jù)的問題之后，非人靈長類全腦圖像大數(shù)據(jù)的處理分析必將是下一個瓶頸。根據(jù)最新的研究報道，國際上剛剛初步解決了小鼠全腦數(shù)據(jù)集的計算問題，數(shù)據(jù)處理能力低于 10 TB。非人靈長類全腦數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)量將達到百 TB，甚至 PB，這對計算和存儲的體系結構，以及軟件技術都提出了巨大挑戰(zhàn)。此外，鼠腦研究中仍然將人工追蹤作為神經(jīng)元形態(tài)重建的金標準，照此推算重建非人靈長類大腦百億級神經(jīng)元規(guī)模的神經(jīng)環(huán)路大約需要 3 000 萬人同時工作一年。因此，利用人工智能技術實現(xiàn)腦內(nèi)信息的全自動識別必將是未來重要的發(fā)展方向。

綜上所述，非人靈長類動物全腦神經(jīng)環(huán)路的構建是極具挑戰(zhàn)的前沿研究，它涉及生物醫(yī)學、信息、物理、化學、數(shù)學、材料、控制等多個學科，需要從基礎到臨床、從科學到工程多個方面，共同圍繞腦科學本身的需求與問題展開研究，這將是我國腦計劃實施中亟待協(xié)同攻關的技術瓶頸。

5 發(fā)展建議

腦科學是未來若干年自然科學領域國際競爭的焦點，搶占國際制高點的關鍵是整合交叉學科力量，加速研發(fā)新技術，并前瞻性地部署未來技術。（1）要充分發(fā)揮中科院在相關學科方向的優(yōu)勢力量，通過頂層設計，與腦科學具體研究和需求結合，研制新型研究技術和體系。（2）建立跨學科、跨單位的雙學位研究生體系，培養(yǎng)腦科學和其他交叉學科的復合型人才，為未來的技術發(fā)展培養(yǎng)和儲備人才。（3）要通過針對性的研討，積極思考和部署未來不可預見的技術方向。通過腦科學研究新技術的研發(fā)，不僅推動腦科學的發(fā)展，也將帶動其他交叉學科的進步。

1 Cheng Z， Hou J， Zhou Q， et al. Sensitivity limits and scaling of bioelectronic graphene transducers. Nano Letters， 2013， 13（6）: 2902-2907.

2 Liu J， Fu T， Cheng Z， et al. Syringe-injectable electronics. Nature Nanotechnology， 2015， 10（7）: 629-636.

3 Gong Y， Huang C， Li J Z， et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science， 2015， 350（6266）: 1361-1366.

4 Storace D， Sepehri Rad M， Kang B， et al. Toward better genetically encoded sensors of membrane potential. Trends Neurosci. 2016， 39（5）: 277-289.

5 Rowland C E， Susumu K， Stewart M H， et al. Electric field modulation of semiconductor quantum dot photoluminescence: insights into the design of robust voltage-sensitive cellular imaging probes. Nano Letters， 2015， 15 （10）: 6848-6854.

6 Chen R， Romero G， Christiansen M G， et al. Wireless magnetothermal deep brain stimulation. Science， 2015，347（6229）: 1477-1480.

7 Keller P， Ahrens M. Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy. Neuron， 2015， 85（3）: 462-483.

8 Shang C F， Mu Y， Du， J L. Zebrafish swimming in neuroscience research: a visible mind in a transparent brain. Science in China: Life Science， 2015， 45（3）: 223-236.

9 Wei P， Liu N， Zhang Z， et al. Processing of visually evoked innate fear by a non-canonical thalamic pathway. Nat Commun，2015， 6: 6756-6768.

10 Yang H， Yang J， Xi W， et al. Laterodorsal tegmentum interneuron subtypes oppositely regulate olfactory cue-induced innate fear. Nat Neurosci， 2016， 19（2）: 283-289.

11 Li A， Gong H， Zhang B， et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science， 2010， 330（6009）: 1404-1408.

12 Quan T， Zhou H， Li J， et al. NeuroGPS-Tree: automatic reconstruction of large-scale neuronal populations with dense neurites. Nat Meth， 2016， 13（1）: 51-54.

杜久林中科院神經(jīng)科學所研究員、所長助理，中科院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心副主任，神經(jīng)科學國家重點實驗室副主任。國家“杰出”青年基金、中科院“百人計劃”、中青年科技創(chuàng)新領軍人才等獲得者；曾獲上海市自然科學牡丹獎、張香桐神經(jīng)科學青年科學家獎、明治生命科學獎、上海市自然科學獎一等獎（第二完成人）、中國高校自然科學獎一等獎（第二完成人）等。1993 年本科畢業(yè)于中國科技大學；1998 年博士畢業(yè)于中科院上海生理所；1999—2000 年任上海生理所助理研究員；2002 年任復旦大學副教授；曾在日本東京大學（2000—2001年）和美國加州大學伯克利分校（2002—2005 年）從事博士后研究；2006 年起任中科院上海生科院神經(jīng)科學所課題組長。創(chuàng)建多項國際領先的斑馬魚在體研究技術，從突觸—神經(jīng)元—神經(jīng)環(huán)路—行為的研究策略出發(fā)，以視覺系統(tǒng)為切入點，研究感覺-運動的神經(jīng)機制以及神經(jīng)調(diào)質(zhì)系統(tǒng)的功能，提出“Bi-Pathway Hypothesis for Behavior Generation”，闡述動物產(chǎn)生適應性行為的神經(jīng)機制；同時拓展交叉研究方向，探索腦血管網(wǎng)絡和血腦屏障的發(fā)育機制及其神經(jīng)調(diào)節(jié)。研究成果主要發(fā)表在 Neuron、Developmental Cell、PLoS Biology、Circulation Research 等學術期刊上。E-mail: forestdu@ion.ac.cn

Du Jiulin Senior Investigator and Assistant Director of Institute of Neuroscience （ION）， Chinese Academy of Sciences （CAS）， and Deputy Director of CAS Center for Excellence for Brain Science & Intelligence Technology and State Key Laboratory of Neuroscience. He is a winner of National Outstanding Young Scientist Award， National Youth Science and Technology Innovation Talents， CAS Hundred Talents Award， and Hsiang-Tung Chang Outstanding Young Neuroscientist Award. He obtained B.S. degree from University of Science & Technology of China in 1993 and Ph.D. degree from Shanghai Institute of Physiology， CAS in 1998， and then did Postdoc studies at Tokyo University and UC Berkeley. He joined ION at 2006 as a PI. His laboratory has developed several novel innovative in vivo methods for zebrafish research， including wholecell recording， intron-based knockin， dopamine release monitoring， and 3-dimensional brain vasculature reconstruction and analysis. He has performed series study on neural circuit mechanisms underlying visuomotor transformation and adaptive behavior generation， and proposed the Bi-Pathway Hypothesis for Behavior Generation. Original research papers have been published on Neuron， Developmental Cell， PLoS Biology，Circulation Research， and so on. E-mail: forestdu@ion.ac.cn

Developing Novel Techniques for Brain Science Research

Du Jiulin1，6Bi Guoqiang2，6Luo Qingming3，6Xu Fuqiang4，6Fang Ying5，6Wang Chen5，6
（1 Institute of Neuroscience， Shanghai Institutes for Biological Sciences， Chinese Academy of Sciences，Shanghai 200031， China；2 University of Science and Technology of China， Hefei 230026， China；3 Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430074， China；4 Institute of Physics and Mathematics， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430071， China；5 National Center for Nanoscience and Technology， Beijing 100190， China；6 Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 200031， China）

The progress of brain science research requires the application of inter-discipline techniques， and in turn promotes the developmentof the latter. In the highly competitive international Brain Research Project， the first priority is to develop new techniques. This review focuses on why and how we are going to tackle several crucial techniques， including measurement of neural signals， optic imaging of neural signals and structures， combination of tans-synaptic tracing and optogenetics， and large-scale re-construction of neural circuits. Through the state-of-the-art design of national brain research-relevant major projects， we can integrate national research efforts and make a breakthrough in this field in the coming future.

microelectrode array， optic imaging， trans-synaptic neural circuit tracing， optogenetics， neural circuit re-construction

10.16418/j.issn.1000-3045.2016.07.007

* 資助項目：中科院戰(zhàn)略性先導科技專項項目（B類）（XDB0200000）
** 通訊作者
修改稿收到日期：2016年6 月10日