天津地區(qū)兒童急性呼吸道和消化道感染Saffold病毒的檢出和臨床流行特征

王維，黃敬孚，林書祥，司萍，李勝英，祝益民，楊洪江

流行病學調(diào)查

天津地區(qū)兒童急性呼吸道和消化道感染Saffold病毒的檢出和臨床流行特征

王維1，黃敬孚1，林書祥1，司萍1，李勝英1，祝益民2，楊洪江3

目的調(diào)查天津地區(qū)兒童急性呼吸道和消化道感染中是否存在Saffold病毒（SAFV）感染及其流行病學特征。方法收集360份急性呼吸道感染患兒鼻咽抽吸物和384份消化道感染患兒糞便標本，以針對SAFV 5′-UTR基因序列設計的特異性引物進行熒光定量PCR擴增，隨機取陽性擴增產(chǎn)物進行核苷酸序列測定，并將所測序列在GenBank中進行比對。計算呼吸道和消化道SAFV感染陽性者的陽性率，不同年齡段及季節(jié)的SAFV陽性構成比和陽性檢出率。同時考察SAFV與其他病毒的混合感染情況。結果呼吸道和消化道檢測SAFV陽性率分別為11.9%（43/360）和16.4%（63/384）。不同性別的呼吸道SAFV陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義［男、女分別為11.5%（28/243）和12.8%（15/117），χ2=0.13，P＞0.05］，年齡6 d～12歲，＜1歲者占79.0%（34/43）；消化道檢測SAFV陽性患兒陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義［男、女分別為13.4%（33/246）和21.7%（30/138），χ2=4.47，P＜0.05］，年齡5 h～11歲。不同年齡段的呼吸道和消化道SAFV陽性檢出率差異均無統(tǒng)計學意義。不同季節(jié)呼吸道SAFV陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義，以冬季和夏季為主（P＜0.01），而消化道SAFV陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義。呼吸道和消化道SAFV與其他病毒混合感染率分別為7.0%（3/43）和12.7%（8/63）。結論天津地區(qū)兒童存在SAFV感染，在急性呼吸道和消化道感染患兒中具有較高的陽性檢出率，且在1歲以內(nèi)患兒中的陽性檢出率較高，應該引起臨床重視。

呼吸道感染；胃腸道；流行病學研究；天津；Saffold心肌炎病毒；兒童

Saffold病毒（SAFV）RNA為微小RNA，屬于無包膜的正鏈單股RNA。心病毒屬、腸道病毒屬、肝炎病毒屬、小RNA病毒屬、鼻病毒屬、口蹄疫病毒屬等均為微小RNA［1-2］。SAFV為1981年從發(fā)熱嬰兒的糞便中分離出的一種新病毒，但直到2007年病毒基因序列擴增研究證實，SAFV是除Vilyuisk人腦脊髓炎病毒（VHEV）外，心病毒屬中第2個可以感染人類的病毒［3］。在急性非脊髓灰質炎性弛緩性麻痹綜合征（AFP）患兒、呼吸道或消化道感染患兒的鼻咽分泌物和糞便中，無菌性腦膜炎患兒的腦脊液標本中均可檢測出SAFV，該病毒普遍存在，呈全球性分布［4-9］。SAFV在臨床上常可引起急性胃腸炎、呼吸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染可致重癥腦炎［1］。SAFV與呼吸道疾?。?-6］、消化道疾?。?-8］、神經(jīng)系統(tǒng)疾病［4，6，9］、1型糖尿?。?］之間的關系為近年來研究的熱點。本研究旨在通過對天津地區(qū)兒童呼吸道和消化道SAFV感染的臨床流行病學特征進行初步分析，探討其與兒童呼吸道和消化道感染的關系。

1　對象與方法

1.1研究對象360份鼻咽抽吸物（NPA）標本來自2013年1月—12月天津市兒童醫(yī)院收治的有明顯急性呼吸道感染癥狀的患兒，男243例（67.5%），女117例（32.5%），年齡40 h～14歲，其中≤1個月者80例（22.2%），2～6個月者117例（32.5%），7～12個月者111例（30.8%），1～3歲者36例（10.0%），4～7歲者13例（3.6%），＞7歲者3例（0.8%）。384份糞便標本來自同期消化道感染患兒，患兒大便呈稀水樣、蛋花樣或稀糊樣，次數(shù)較平時增多，伴或不伴發(fā)熱，嘔吐；男246例（64.1%），女138例（35.9%），年齡5 h～13歲，其中≤1個月者71例（18.5%），2～6個月者78例（20.3%），7～12個月者176例（45.8%），1～3歲者32例（8.3%），4～7歲者19例（4.9%），＞7歲者8例（2.1%）。

1.2標本收集與處理急性呼吸道感染患兒入院后用一次性吸痰管吸取患兒鼻咽分泌物1～2 mL，置于含有6～8 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）的離心管中充分混合。樣本懸液于2 000 r/min離心10 min，收集細胞做細胞涂片，采用直接免疫熒光測定法檢測7種常見的呼吸道病毒：流感病毒A、B型（IFV A、IFV B），腺病毒（ADV），合胞病毒（RSV），副流感病毒1、2、3型（PIV1、PIV2、PIV3）。試劑盒為D3Ultra DFA RespiratoryVirusScreening&IDKit（DIAGNOSTICHYBRIDS，Inc. USA）。剩余標本立即于-70℃保存，供后續(xù)病毒檢測使用。

消化道感染患兒糞便標本分裝前，采用金標法檢測輪狀病毒（RtV）、ADV（RtV、ADV抗原檢測試劑盒購自艾博生物醫(yī)藥杭州有限公司），酶標法檢測星狀病毒（AtV，德國拜發(fā)公司）。同一份樣本分裝2管，每管約1 mL。標本檢測前編號并置于-70℃保存。

1.3Real-time PCR檢測SAFV標本室溫解凍后用Trizol（Invitrogen）提取病毒RNA，用隨機六聚體引物逆轉錄合成cDNA（Quant cDNA第一鏈合成試劑盒，天根生化科技北京有限公司），保存于-20℃?zhèn)溆?。操作過程嚴格按照說明書進行。運用Real-time PCR法對SAFV保守區(qū)5′-UTR片段進行擴增，引物序列SAFV（5′→3′）：上游TGGCGTGGTTG?GAATTAACATC（293～314 bp）；下游GGGCAGAAAACATCA?CATAATCG（345～367 bp）；SAFV-P探針：TTTCCGAC?GAAAGTGCTATCATGCCTCC（316～343 bp）。試劑盒采用天根SuperReal Premix（Probe）熒光定量預混試劑（探針法），目的片段大小約70 bp。每次PCR反應均設立陰性和陽性對照。SAFV陽性參考毒株由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所李利利教授惠贈。Ct值≤35.0且曲線有明顯的指數(shù)增長期判斷為檢測樣本陽性。隨機取陽性樣本的Realtime PCR擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，將擴增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，并在GenBank上比對。

1.4其他病毒檢測運用PCR及Real-time PCR方法，對360份鼻咽抽吸物標本檢測鼻病毒［10］、多瘤病毒W(wǎng)U［11］、多瘤病毒KI［12］；對384份糞便標本檢測人博卡病毒（HBoV）［13］、腦心肌炎病毒（EMCV）［14］、諾如病毒（NOV）［15］、腸道病毒（EV）［13］、Aichi病毒［13］及雙?？刹《荆℉PeV）［13］。

1.5結果判斷計算呼吸道和消化道SAFV感染的陽性率，不同年齡段及季節(jié)的SAFV陽性構成比和陽性檢出率。陽性率=陽性例數(shù)/總樣本數(shù)×100%，陽性構成比=每組陽性例數(shù)/總陽性例數(shù)×100%，陽性檢出率=每組陽性例數(shù)/每組的樣本總數(shù)×100%。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件。符合正態(tài)分布的計量資料用表示。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1SAFV檢測結果呼吸道和消化道檢測SAFV陽性率分別為11.9%（43/360）和16.4%（63/384）。擴增出來的產(chǎn)物電泳顯示，SAFV陽性標本在70 bp出現(xiàn)單一清晰條帶，與預期結果相符，見圖1。測序結果在GenBank上比對證實為SAFV。

2.2SAFV感染患兒的性別和年齡分布不同性別的呼吸道SAFV陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義［男、女分別為11.5%（28/243）和12.8%（15/117），χ2= 0.13，P＞0.05］，陽性患兒年齡6 d～12歲，1歲內(nèi)占79.0%（34/43）；不同性別的消化道SAFV陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義［男、女分別為13.4（33/246）和21.7%（30/138），χ2=4.47，P＜0.05］，陽性患兒年齡5 h～11歲。不同年齡段的呼吸道和消化道SAFV陽性檢出率差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

Fig.1SAFV detection in electrophoresis圖1　SAFV檢測結果

Tab.1Viral positive constituent ratio and positive detection rate in different age groups表1　不同年齡段患兒SAFV陽性情況

2.3SAFV感染的季節(jié)分布及不同部位的感染情況不同季節(jié)呼吸道SAFV陽性檢出率差異有統(tǒng)計學意義，且以冬季和夏季為主（P＜0.01），而消化道SAFV陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.4SAFV感染臨床分析呼吸道43例SAFV陽性患兒中原發(fā)病診斷為支氣管肺炎39例（包括新生兒肺炎3例），支氣管哮喘2例，急性化膿性扁桃腺炎2例；其中同時伴有腹瀉3例、粒細胞減少癥5例、貧血6例、泌尿系感染2例、新生兒化膿性腦膜炎2例、新生兒敗血癥1例。

消化道63例SAFV陽性患兒的原發(fā)病均為腹瀉，其中伴有呼吸道感染48例（包括上呼吸道感染11例，支氣管肺炎37例，后者中新生兒肺炎7例），病毒性腦炎6例、癲癇5例（其中嬰兒痙攣2例）、病毒性皮疹7例、輕度脫水2例、粒細胞減少癥11例、貧血4例、鼻炎2例及泌尿系感染3例。

2.5混合感染呼吸道共檢出PIV1 2例、PIV3 13例、IFV A 1例、RSV 28例、ADV 1例、鼻病毒6例、多瘤病毒KI 18例。消化道共檢出RtV 26例、AtV 8例、ADV 7例、HBoV 5例、EMCV 6例、NOV 15例、EV 8例，Aichi病毒3例，HPeV 11例。SAFV與其他病毒存在混合感染的情況：呼吸道SAFV陽性樣本中混合感染RSV 2例、PIV3 1例，混合感染率7.0%（3/43）。消化道SAFV陽性樣本中混合感染EMCV 2例、NOV 4例、HPeV 2例，混合感染率12.7%（8/63）。

Tab.2Seasonal distribution of SAFV infection表2　SAFV檢出的季節(jié)分布

3　討論

本研究在鼻咽抽吸物標本中共檢出43例SAFV陽性，陽性率為11.9%，高于日本2008年（2.1%）［16］、北京2007—2009年（0.5%）［17］、香港2013—2014年（未有檢出）［18］的研究結果，與長沙2007—2008年（10.4%）［19］的研究結果近似。消化道共檢出63例SAFV陽性，陽性率為16.4%，高于北京2006—2007年（3.2%）［20］、泰國2007年（2.7%）［21］、蘭州2006—2008年（0.5%）［5］、上海2008—2010年（1.1%）［22］、丹麥2009—2011年（2.8%）［23］、日本2010—2011年（1.5%）［24］的研究結果。德國和巴西的相關研究顯示胃腸炎患兒的糞便中SAFV陽性檢出率分別為7.8%（4/51）和1.1%（2/188）［7］。巴基斯坦和阿富汗的相關研究顯示患有急性遲緩性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）患兒的943份糞便中，可以檢測到88例SAFV陽性，陽性率為9.3%［25］。截至目前，關于呼吸道和消化道標本SAFV陽性檢出情況的報道多在2011年前，關于近兩年SAFV與兒童急性呼吸道和消化道感染關系的研究較少，因此，結合本研究結果，筆者認為該病毒在國內(nèi)的流行可能有增加的趨勢。

通過對歐洲、非洲和亞洲等國家的人群進行血清學研究發(fā)現(xiàn)，在＞24個月的大齡兒童及成人中SAFV血清抗體的陽性率可高達90%［8］。另有研究亦認為，SAFV感染多見于6歲以下兒童［1，6-7］。因此，可以推測該病毒感染可能多發(fā)生在小兒早期。本研究數(shù)據(jù)顯示，呼吸道陽性患兒年齡最小可至1個月，最大12歲，且1歲以下感染患兒占全部陽性患兒的79%，與日本［16］、北京［17］的研究結果近似。消化道SAFV陽性感染患兒年齡主要集中在3歲以內(nèi)，也與多地相關報道一致［5-6，20］。

多地研究關于SAFV感染的高峰季節(jié)的報道不一。在對呼吸道標本的檢測中，日本［16］、北京［17］均未發(fā)現(xiàn)明顯的SAFV感染季節(jié)差異，長沙地區(qū)［19］的感染高峰主要集中于4、5月份。本研究顯示，呼吸道SAFV感染高峰為夏、冬季；消化道SAFV感染一年四季均可發(fā)生。另有研究顯示，北京SAFV陽性患兒均為2007年11月的住院患兒［20］；蘭州4例SAFV陽性標本分別為6月1例，9月1例，10月2例，沒有明顯規(guī)律［5］。因此，筆者認為，SAFV感染在不同地區(qū)的季節(jié)差異可能與不同國家、不同地域的地理環(huán)境和氣候有關，但確切的情況還需要長時間、大樣本的監(jiān)測。

通常情況下，SAFV可與多種病毒存在混合感染，且存在較高的合并感染率。呼吸道標本中，北京［17］7例陽性標本中有3例分別混合感染肺炎支原體（MP）、RSV和EV，混合感染率為42.9%；長沙［19］檢測陽性患兒中合并其他病毒感染的有47例，占感染患兒的70.2%（47/67）。糞便標本中，北京［20］12例陽性標本中有5例混合感染NOV，7例混合感染RtV，混合感染率為11/12；泰國［21］和蘭州［5］的陽性標本全部存在與其他病毒（HPeV、NOV、RtV）的混合感染；上海［22］有6例陽性標本，其中有3例存在與NOV或RtV的混合感染；日本［24］也有4/7的陽性標本存在與NOV、RtV或HBoV的混合感染。本文檢出的7.0%（呼吸道）和12.7%（消化道）的合并感染率略低于以上報道，考慮這可能與各地區(qū)多種不同呼吸道和消化道病毒的流行情況有關。

綜上所述，天津地區(qū)兒童存在SAFV感染，相對其他城市，在急性呼吸道和消化道感染患兒中具有較高的檢出率，且在1歲以內(nèi)患兒的陽性構成比較高，應該引起臨床重視。本研究有助于完善本地區(qū)兒童急性呼吸道和消化道的病毒病原譜，但關于明確該病毒對兒童急性呼吸道和消化道疾病的關系及影響，還有待進一步深入研究。

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（2015-12-14收稿2016-04-22修回）

（本文編輯陸榮展）

Saffold virus detection and epidemiological characteristics in children with acute respiratory infection or digestive tract infection in Tianjin

WANG Wei1，HUANG Jingfu1，LIN Shuxiang1，SI Ping1，LI Shengying1，ZHU Yimin2，YANG Hongjiang3
1 Pediatric Research Institute，Tianjin Children's Hospital，Tianjin 300134，China；2 Emergency Center，Hunan Children's Hospital；3 College of Life Science，Tianjin University of Science&Technology

ObjectiveTo investigate prevalence and epidemiologic features of Saffold virus（SAFV）in hospitalized children with acute respiratory infection or digestive tract infection Tianjin area.MethodsNasopharyngeal aspirates from children with acute respiratory infection and fecal samples from children with digestive tract infection in Tianjin Children's Hospital were collected from January 2013 to December 2013.Viral nucleic acid was extracted，and SAFV infection was determined by using real-time quantitative PCR.Positive PCR products were sequenced.The sequencing results were aligned with known gene sequences of SAFV sequences in GenBank.The positive viral infection rate of nasopharyngeal aspirates and fecal samples，viral positive constituent ratio and positive detection rate in different age groups，seasonal distribution of SAFV infection were calculated. Other common respiratory tract or digestive tract viruses were also detected.ResultsFourty-three（11.9%）nasopharyngeal aspirates from children with acute respiratory infection tested positive for SAFV.There was no significant difference between male and female infected children（aged between 6 d and 12 years old）.The 79%（34/43）of the patients with SAFV infection aged under 1 year old.The infection most occurred in summer and winter.The 63（16.4%）fecal samples from children with digestive tract infection tested positive for SAFV.There was significant difference between male and female infected children（aged between 5 h and 11 years old）.SAFV infection was found to be year round.There was no significant difference in different age groups of nasopharyngeal aspirates and fecal samples.The mixed infection rate with SAFV and other respiratory tract or digestive tract viruses were 7.0%（3/43）and 12.7%（8/63），respectively.ConclusionInfection of SAFV had occurred in children with acute respiratory infection or digestive tract infection in Tianjin.SAFV has high detection rate in these children and is more common in childrenaged under 1 year old.The data suggest that some of acute respiratory infection or digestive tract infections in pediatric patients are related to SAFV.The Clinical doctors should pay attention to them.

respiratory tract infections；gastrointestinal tract；epidemiologic studies；TIANJIN；Saffold virus；children

R725.7，R181.32

A

10.11958/20150392

國家十二五科技支撐計劃（2012BAI04B01）；國家自然科學基金項目（31370205）；天津市衛(wèi)生局科技基金（2012KY11）

1天津市兒童醫(yī)院，天津市兒科研究所（郵編300134）；2湖南省兒童醫(yī)院急救中心；3天津科技大學生物工程學院

王維（1980），女，副研究員，主要從事兒童病毒感染相關研究