基因芯片技術(shù)診斷耐多藥結(jié)核病的臨床應(yīng)用研究

高會霞，馮愛東，柳曉金，戴二黑

基因芯片技術(shù)診斷耐多藥結(jié)核病的臨床應(yīng)用研究

高會霞，馮愛東，柳曉金，戴二黑△

目的探討基因芯片法檢測耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐藥相關(guān)基因rpoB、katG和inhA突變的特點，評估其臨床應(yīng)用價值。方法選取2013—2014年石家莊地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株76株，采用基因芯片法檢測rpoB、katG及inhA基因耐藥突變位點及頻率，以比例法藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評價基因芯片法檢測菌株耐藥的準(zhǔn)確度、靈敏度和特異度，Kappa檢驗評價基因芯片法和比例法藥敏結(jié)果的一致性。結(jié)果在76株石家莊地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，69株檢測到katG/inhA基因發(fā)生單一或聯(lián)合突變，其中katG基因優(yōu)勢突變位點為315，占89.9%（62/69），5.8%（4/69）存在inhA-15（C→T）突變，4.3%（3/69）發(fā)生katG 315位點和inhA啟動子區(qū)域的聯(lián)合突變。73株檢測到rpoB基因發(fā)生突變，優(yōu)勢突變位點為531，占64.4%（47/73）；其次是526，突變率為15.1%（11/73）；12.3%（9/73）發(fā)生516位點突變；1.4%（1/73）發(fā)生513位點突變；1.4%（1/73）發(fā)生533位點突變；另有5.5%（4/73）發(fā)生多位點的聯(lián)合突變。以比例法藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測利福平耐藥的敏感度為96.1%（73/ 76），特異度為100.0%（50/50），總準(zhǔn)確度為97.6%（123/126）；檢測異煙肼耐藥的敏感度為90.8%（69/76），特異度為100.0%（50/50），總準(zhǔn)確度為94.4%（119/126）；基因芯片法檢測耐多藥結(jié)核的敏感度為86.8%（66/76），特異度為100.0%（50/50），總準(zhǔn)確度為92.1%（116/126）。結(jié)論本地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因優(yōu)勢突變類型為katG基因315位點和rpoB基因531位點，基因芯片法可快速、有效診斷耐多藥結(jié)核病。

利福平；異煙肼；分枝桿菌，結(jié)核；結(jié)核，抗多種藥物性；基因芯片；耐多藥結(jié)核病

結(jié)核病是威脅全球公共衛(wèi)生的重大傳染病之一。2015年世界衛(wèi)生組織（WHO）全球結(jié)核病報告顯示，2014年全球約有960萬新發(fā)結(jié)核病例，其中耐多藥結(jié)核?。╩ulti-drug resistant tuberculosis，MDR-TB）約48萬，死亡19萬人［1］。MDR-TB是指至少同時對異煙肼（isoniazid，INH）和利福平（rifampicin，RFP）耐藥［2］，而不論是否對其他藥耐藥的結(jié)核病。診斷MDR-TB的傳統(tǒng)方法是藥物敏感性試驗，從標(biāo)本接種到結(jié)果報告需6～9周，這不僅影響患者的早期診斷和治療，還可能導(dǎo)致MDR-TB在社區(qū)中傳播。近年來，通過分析耐藥基因突變位點來診斷耐藥性的檢測技術(shù)迅速發(fā)展，將耐藥檢測的時間縮短到6 h，達到了快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測耐藥性的目的。研究發(fā)現(xiàn)，katG和inhA基因突變與INH耐藥密切相關(guān)，rpoB基因突變與RFP耐藥密切相關(guān)［3-4］。本研究采用晶芯生物芯片診斷法對耐多藥結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）臨床分離株耐藥基因katG、inhA及rpoB突變位點和頻率進行檢測，旨在探討該方法在診斷石家莊地區(qū)MDR-TB中的臨床應(yīng)用價值。

1　資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株來源2013年1月—2014年12月我院住院并納入全球耐多藥基金項目的MDR-TB患者［5］臨床分離株76株?；颊邅碜允仪f市各地，其中男50例，女26例，年齡17～77歲，平均（35.33±15.49）歲；初治30例，復(fù)治46例。收集同時期住院患者50株全敏感臨床分離株作為對照組。質(zhì)控菌株H37Rv（ATCC27294）標(biāo)準(zhǔn)株，由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室提供。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑BBLMGITTM7 mL培養(yǎng)管、BACTECTMMGITTM960生長添加劑和雜菌抑制劑為美國BD公司產(chǎn)品（國械注進20142405711）；改良羅氏培養(yǎng)基和含藥羅氏培養(yǎng)基購自河南賽諾特生物技術(shù)有限公司［注冊號為豫食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2011第2400304號］。MTB核酸提取和PCR-熒光探針法檢測試劑為北京博奧生物有限公司生產(chǎn)的“晶芯”分枝桿菌核酸檢測（PCR-熒光探針法）試劑盒［國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2010第3400530號］。MTB耐藥基因芯片法檢測試劑為北京博奧生物有限公司生產(chǎn)的“晶芯”MTB耐藥基因檢測試劑盒（DNA微陣列芯片法）［國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2010第3400383號］。

1.1.3主要儀器ABI 7300熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；BACTECTMMGITTM960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)（美國BD公司）；Centrifuge 5810 R臺式高速低溫離心機（德國eppendorf公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ExtractorTM36核酸快速提取儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、Slide-WasherTM8芯片洗干儀、LuxScanTM10KB微陣列芯片掃描儀（博奧生物有限公司）。

1.2方法

1.2.1菌種初步鑒定及藥物敏感性試驗采用WHO全球結(jié)核病耐藥監(jiān)測項目指南［6］推薦濃度，采用比例法檢測菌株的耐藥性。痰標(biāo)本按BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)標(biāo)本前處理程序進行處理后，接種到BBLMGITTM7 mL培養(yǎng)管。儀器報告陽性生長后立即進行抗酸染色，顯微鏡鏡檢進行確認(rèn)并觀察抗酸桿菌生長情況，采用濃度梯度稀釋法稀釋成1×10-2和1×10-4mg/L菌懸液，將上述菌懸液0.1 mL分別接種到對硝基苯甲酸（PNB）/噻吩-2-羧酸酰肼（TCH）鑒別培養(yǎng)基、6種含藥培養(yǎng)基和不含藥培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)4周，觀察結(jié)果。每批實驗以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作陽性平行對照。根據(jù)PNB和TCH鑒別培養(yǎng)基的生長情況，初步鑒定MTB復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌（Non-tuberculosis mycobacteria，NTM），其濃度分別為500和5 mg/L。4種一線抗結(jié)核藥物INH、RFP、鏈霉素（streptomycin，SM）、乙胺丁醇（ethambutol，EMB）和2種二線抗結(jié)核藥物氧氟沙星（ofloxacin，OFx）、卡那霉素（kanamycin，Km）進行藥物敏感性試驗。6種藥物的臨界濃度分別為0.2、40、4、2、2和30 mg/L。含藥培養(yǎng)基生長的菌落≥不含藥培養(yǎng)基的1%，判定為耐藥；＜不含藥培養(yǎng)基的1%，判定為敏感。

1.2.2DNA提取將報陽后第3～5天BBLMGITTM7 mL培養(yǎng)管在5 000 r/min離心15 min，取10 μL沉淀，加入含50 μL核酸提取液的核酸提取管中，放入核酸提取儀（Extractor36），充分振蕩5 min，95℃水浴鍋中放置5 min，5 000 r/min離心1 min，吸取150 μL上清到另一1.5 mL離心管中，放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR-熒光定量法檢測MTB核酸本方法采用雙重PCR技術(shù)和TaqMan探針技術(shù)相結(jié)合的方法，分別針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和分枝桿菌的特異性序列設(shè)計引物，定性檢測所提取的分枝桿菌核酸，鑒別MTB/NTM。

1.2.4基因芯片法檢測INH及RFP耐藥基因檢測指標(biāo)包括RFP的耐藥相關(guān)基因rpoB和INH的耐藥相關(guān)基因katG和inhA。INH耐藥相關(guān)基因katG和inhA各檢測1個位點，katG檢測315位點（AGC→ACC，AGC→AAC），inhA檢測-15位點（C→T）。RFP耐藥相關(guān)基因rpoB檢測6個位點13種突變型，包括531（TCG→TTG，TCG→TGG）、513（CAA→CCA，CAA→AAA）、526（CAC→GAC，CAC→TAC，CAC→CTC、CAC→CGC）、511（CTG→CCG）、516（GAC→GTC，GAC→TAC，GAC→GGC）及533（CTG→CCG）等。將提取的DNA按試劑盒說明書進行PCR擴增、芯片雜交、洗滌、甩干和結(jié)果掃描判讀。以試劑盒自帶的陰性、陽性對照菌株作為質(zhì)控菌株。判讀時，在質(zhì)控探針全部正常情況下，若野生型探針未出現(xiàn)信號而相應(yīng)突變型探針出現(xiàn)信號，則判斷為突變型；若野生型探針出現(xiàn)了信號，而突變型未出現(xiàn)信號，則判讀為野生型；若野生型和突變型均沒有信號，但菌種鑒定探針出現(xiàn)信號，或野生型和突變型的信號相差未達到軟件判讀閾值，則為無法判讀，即此標(biāo)本無結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。以比例法藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，采用χ2檢驗比較2種方法檢驗結(jié)果差異性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。運用Kappa檢驗比較2種方法檢驗結(jié)果的一致性（Kappa≥0.75，兩者一致性較好；0.4≤Kappa＜0.75，兩者一致性一般；Kappa＜0.4，兩者一致性較差）。

2　結(jié)果

2.1MDR-TB的耐藥譜納入研究的石家莊地區(qū)76株耐多藥MTB藥敏結(jié)果見表1。

Tab.1Drug resistance patterns of 76 multi-drug resistant MTB strains表1　76株耐多藥MTB的耐藥譜

2.2基因芯片檢測相關(guān)突變位點結(jié)果見表2?；蛐酒@示，50株全敏感株均未檢到突變。在76株MDR-TB臨床分離株中，73株檢測到rpoB基因6個位點12種突變型，69株僅存在單一位點突變，4株存在多位點突變。突變頻率最高是531位點，突變率64.4%（47/73），其次是526，突變率為15.1%（11/73）。在3株基因芯片法未檢測到rpoB基因突變的菌株中，通過基因測序法發(fā)現(xiàn)有1株為516位點合并515位點突變，另2株無突變。69株檢測到katG/inhA基因發(fā)生單一或聯(lián)合突變，62株發(fā)生katG315位點單一突變，占89.9%（62/69），5.8%（4/ 69）存在inhA-15（C→T）突變，4.3%（3/69）株發(fā)生katG315位點和inhA啟動子區(qū)域的聯(lián)合突變。

2.3基因芯片法與比例法檢測結(jié)果的比較以比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，比例法和基因芯片法檢測RFP耐藥的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩者檢測3個指標(biāo)的Kappa＞0.75，說明2種方法一致性較好。見表3、4。

Tab.2Mutation positions of rpoB，katG and inhA detected by gene chip表2　基因芯片法檢測rpoB、katG和inhA耐藥相關(guān)突變位點的分布

Tab.3Evaluation of gene chip method for rifampicin and isoniazid resistance表3　基因芯片技術(shù)檢測RFP、INH耐藥情況的評價結(jié)果

Tab.4Evaluation of gene chip for multi-drug resistance表4　基因芯片技術(shù)檢測MDR-TB情況的評價結(jié)果

3　討論

近年來，由于耐多藥菌株及廣泛耐多藥菌株的出現(xiàn)和傳播，造成全球結(jié)核病疫情回升，并更加難以控制，甚至引起暴發(fā)流行。MDR-TB的治療缺乏有效的藥物，病情發(fā)展迅速，病死率高達37%，在合并人免疫缺陷病毒（HIV）感染的患者中病死率更高，達72%～89%［7］。實驗室檢測耐藥結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)是以MTB的生長為判讀標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)藥敏方法，得到確定結(jié)果需要數(shù)周時間。如果是MDR-TB患者，需要等待數(shù)周得到藥敏結(jié)果，不能及時選擇合適的化療方案，可能導(dǎo)致疾病在人群中播散。

3.1基因芯片技術(shù)檢測MDR-TB的方法學(xué)評價隨著對抗結(jié)核藥物耐藥分子機制認(rèn)識的深入，多種基于基因突變的快速分子診斷技術(shù)取得了飛速發(fā)展。本研究中使用的晶芯結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測技術(shù)是一類在固相介質(zhì)表面進行的雜交檢測技術(shù)，可同時檢測INH和RFP耐藥。從獲得標(biāo)本或臨床分離株到得出結(jié)果僅需約6 h。本研究采用基因芯片法檢測RFP耐藥敏感度和特異度分別為96.1%和100.0%，INH分別為90.8%和100.0%。耿紅等［8］采用Meta分析結(jié)果表明，基因芯片法檢測INH和RFP耐藥的敏感度為89%～92%和77%～81%。目前商品化的DNA微陣列芯片法在國內(nèi)的多中心驗證結(jié)果顯示，該方法檢測RFP耐藥敏感度和特異度為87.56%和97.95%，檢測INH耐藥敏感度和特異度為80.34%和95.82%［9］。本研究結(jié)果高于我國多中心研究數(shù)據(jù)，分析原因可能與本研究選取的病例均為臨床確診的MDR-TB患者，臨床分離株均為細(xì)菌室分離純化得到的菌株有關(guān)?；蛐酒z測katG/inhA和rpoB基因聯(lián)合突變對診斷MDR-TB的敏感度和特異度分別為86.8%和100%，與以往的研究敏感度74.6%、82.61%、79%和特異度98%、98.16%、97%接近［10-11］。結(jié)果提示，基因芯片法聯(lián)合檢測katG/inhA和rpoB基因?qū)υ\斷石家莊地區(qū)MDR-TB具有較高的敏感度和特異度。

3.2katG及inhA基因突變與INH耐藥隨著對MTB耐藥分子機制認(rèn)識的逐步深入，對MTB耐藥突變的位點分布、突變類型、突變頻率的掌握是基因芯片等分子診斷方法研究的基礎(chǔ)，決定了其檢測性能。MTB對INH的耐藥分子機制涉及多個基因，目前研究表明katG基因［12］及inhA基因突變［13］參與INH耐藥。katG基因突變最常見的是315密碼子的Ser→Thr突變，在大約50%～90%的INH耐藥菌株中出現(xiàn)，katG基因315位點突變發(fā)生率具有較大的地區(qū)差異性［14］。本研究結(jié)果顯示，在76株MDR中，69株檢測到katG、inhA基因發(fā)生單一或聯(lián)合突變，62株發(fā)生katG315位點單一突變，突變率為89.9%（62/69），是本地區(qū)最常見的INH耐藥突變類型，略高于江西（65.8%）［15］、上海（72.7%）［16］、貴州（78.06%）［17］福建（82.7%）［18］和尼泊爾（81.4%）［19］。近年的研究表明katG315位點突變率高與MDR的表型有一定相關(guān)性［14］，本研究結(jié)果也證實此觀點。3%～30%的耐INH菌株中存在inhA啟動子區(qū)突變，最常見的突變類型是-15（C）C→T，inhA啟動子基因調(diào)節(jié)區(qū)最常見的是-15位點的突變，本研究結(jié)果顯示inhA基因的突變型只有-15位點的C→T；文獻報道inhA基因伴隨katG315同時突變的對INH耐藥呈協(xié)同作用，本研究中7株inhA基因突變中只有3株伴隨katG315位點的聯(lián)合突變，低于福建?。?2.5%）［18］。

3.3rpoB基因突變與RFP耐藥目前研究表明，約96%～98%的MTB對RFP耐藥與rpoB基因突變相關(guān)，rpoB基因突變集中在其507～533位密碼子的81 bp高變區(qū)域，最常見的突變密碼子為531和526位點［3］。本研究結(jié)果顯示，96.1%的MDR菌株檢測到rpoB基因突變，突變頻率由高到低依次為531（64.4%）、526（15.1%）、516（12.3%）、513和533位點（突變率均為1.4%），并有5.5%菌株發(fā)生多位點的聯(lián)合突變。以前的研究表明不同地區(qū)rpoB基因突變類型存在一定變化，本研究結(jié)果顯示本地區(qū)rpoB531位點突變頻率為64.4%，與同樣以MDR菌株為研究對象，上海［16］和黑龍江［20］突變率61.2%和72.5%相近，而比以單RFP耐藥菌株為研究對象，上海（38.5%）［16］和貴州（55.07%）［21］突變頻率高。以上研究表明，MDR菌株rpoB531位點基因突變頻率高于單RFP耐藥菌株。

綜上所述，基因芯片法可以快速檢測MTB對INH和RPF的耐藥性，從而快速準(zhǔn)確診斷MDRTB?；蛐酒ㄔ谀退幗Y(jié)核病的臨床診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景，但目前傳統(tǒng)藥敏方法仍無法完全被取代，兩者結(jié)合使用將為臨床診斷提供更可靠的實驗室數(shù)據(jù)。

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（2015-11-04收稿2016-06-06修回）

（本文編輯李鵬）

The application of gene chip in detecting the mutation of drug resistant gene in multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains

GAO Huixia，F(xiàn)ENG Aidong，LIU Xiaojin，DAI Erhei△
Department of Laboratory Medicine，the Fifth Hospital of Shijiazhuang，Shijiazhuang 050021，China△

E-mail：daieh2008@126.com

ObjectiveTo understand the mutation characteristics of drug resistance-associated genes rpoB，katG and inhA in Mycobacterium tuberculosis（MTB）strains using gene chip method，and evaluate its clinical application value. MethodsA total of 76 MTB strains were collected from Shijiazhuang area in 2013 to 2014.Gene chip was used to detect the mutations of rpoB，katG and inhA，and the L-J proportion drug susceptibility test was used as the gold standard to evaluate the overall concordance，sensitivity and specificity of gene chip.The consistency of microarray and phenotypic resistance was evaluated by Kappa test.ResultsOf all the 76 strains detected，69 harbored mutations in katG/inhA.The predominant mutation site of katG was 315 codon with the mutation rate of 89.9%（62/69），and 5.8%（4/69）carried mutations at inhA-15（C→T），and 4.3%（3/69）carried combined mutations of katG 315 and inhA-15.The rpoB mutations were detected in 73 strains，of which 64.4%（47/73）carried mutations at codon 531，15.1%（11/73）at codon 526，12.3%（9/73）at 516 codon，1.4%（1/73）at 513 codon，1.4%（1/73）at 533 codon and 5.5%（4/73）had combined mutations. Compared with results from the L-J proportion method，the sensitivity，specificity and concordance rates of gene chip for RFP were 96.1%（73/76），100%（50/50）and 97.6%（123/126）.The sensitivity，specificity and concordance rates of gene chip for INH were 90.8%（69/76），100%（50/50）and 94.4%（119/126）.The sensitivity，specificity and concordance rates of gene chip for MDR-TB were 86.8%（66/76），100%（50/50）and 92.1%（116/126）.ConclusionThe predominant mutation loci of MDR strains in Shijiazhuang area are katG315 and rpoB531.Gene chip is a fast and useful tool for clinical diagnosis of MDR strains.

rifampin；isoniazid；mycobacterium tuberculosis；tuberculosis，multidrug-resistant；gene chip；multi-drug resistant tuberculosis

R372，R378.911

A

10.11958/20150264

河北省衛(wèi)生廳計劃性課題（20150155）

石家莊市第五醫(yī)院檢驗科（郵編050021）

高會霞（1973），女，副主任檢驗師，碩士，主要從事臨床微生物檢驗與細(xì)菌耐藥檢測研究

E-mail：daieh2008@126.com