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    銅尾礦優(yōu)勢先鋒植物根際聯(lián)合固氮特性

    2016-10-20 16:15:51陳宣文危志鋒林銳
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年7期
    關(guān)鍵詞:白茅香蒲

    陳宣文 危志鋒 林銳

    摘要:為了探明尾礦先鋒植物的根際聯(lián)合固氮特性,對安徽銅陵林沖新棄置銅尾礦主要優(yōu)勢先鋒植物香蒲(濕生)、白茅(旱生)根際聯(lián)合固氮特性進(jìn)行系統(tǒng)性研究。研究結(jié)果表明:香蒲、白茅根際土柱固氮活性分別為32.43、19.27 μmol/(m2·h),二者差異明顯。分析2種植物根系和根際土固氮活性發(fā)現(xiàn),香蒲根系和根際土的固氮活性大于白茅,表明植物根際聯(lián)合固氮活性與植物種類有關(guān)。尾礦先鋒植物不同部位固氮活性排序?yàn)椋焊?根際土>根外土>空白,表明植物根系是植物重要的固氮部位。從尾礦不同樣品中共分離12株具有固氮活性的菌株,固氮活性在7.15~3 416.98 nmol/(mL·h)之間。對其中2株高活性的菌株ATWG5、ATWG9進(jìn)行16S r DNA 序列分析,結(jié)果表明ATWG5號菌株與Azorhizobium caulinodans親源關(guān)系最近,相似性達(dá)到100%,ATWG9號菌株與Klebsiella oxytoca親源關(guān)系最近,相似性達(dá)到98.75%。

    關(guān)鍵詞:銅尾礦;先鋒植物;根際聯(lián)合固氮;固氮活性;香蒲;白茅

    中圖分類號: X171.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2016)07-0488-04

    尾礦是經(jīng)礦石粉碎、浮選后余下的微粒狀固體,絕大多數(shù)尾礦被堆置在尾礦庫內(nèi),丟棄后的尾礦庫形成了尾礦廢棄地,這不僅占有和破壞大量土地,還給周邊地區(qū)帶來諸如空氣、水污染,生態(tài)系統(tǒng)退化,農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)降低等一系列問題[1]。

    植被恢復(fù)是治理尾礦污染的一種較為理想的方法[2-3],但尾礦所具有的如物理結(jié)構(gòu)性差、異常貧瘠(如有機(jī)質(zhì)、氮素含量幾乎為零)、極端pH值、重金屬濃度過高等特性,對植被恢復(fù)極為不利。盡管如此,隨著棄置年限的增加,尾礦原生環(huán)境中先鋒植物開始定居。實(shí)地考察發(fā)現(xiàn),林沖尾礦未復(fù)墾廢棄地先鋒植物以非豆科植物為主,表明尾礦極端生境中非豆科植物先鋒植物生長過程中具有穩(wěn)定而可靠的氮源,認(rèn)為這些氮源主要來自先鋒植物根際聯(lián)合固氮[4]。

    聯(lián)合固氮是自由生活的固氮菌定植于植物根表細(xì)胞和根際土壤中形成的特殊固氮作用。當(dāng)固氮微生物定植在植物根際,并與之形成一種松散的聯(lián)合固氮狀態(tài)時,植物根系就為其提供良好的固氮環(huán)境,與自生固氮相比表現(xiàn)出更高的固氮效率[5]。研究表明,聯(lián)合固氮菌通過固氮作用除了為宿主植物提供氮素營養(yǎng)之外,還可以通過分泌植物生長激素類物質(zhì)等多種途徑促植物生長[6]。目前,有關(guān)根際聯(lián)合固氮的認(rèn)識,主要關(guān)于普通環(huán)境及生長在普通環(huán)境的植物上,而關(guān)于尾礦極端生境的先鋒植物根際聯(lián)合固氮的信息明顯缺乏。

    本研究通過對安徽銅陵林沖新棄置的銅尾礦2種具有代表性的優(yōu)勢先鋒植物香蒲(濕生)、白茅(旱生)根際聯(lián)合固氮活性的分析,可為明確銅尾礦生態(tài)系統(tǒng)氮素的積累和植被的生態(tài)恢復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集與處理

    2014年7月,于安徽省鳳凰山林沖新棄置未復(fù)墾尾礦,采集尾礦裸露地(空白)、結(jié)皮、香蒲、白茅根際土柱,同時采集香蒲、白茅根、根外土(距離根部較遠(yuǎn),根系沒有影響的地方)及空白(未生長植被的裸露地),裝入自封采樣袋中帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃冰箱中保存,待測。

    1.1.1 土柱取樣 用直徑為4.8 cm、長度為12 cm的PVC管子套住植物,從上到下打入土中,上部留有1 cm左右的間隙,用鏟子將土柱完整鏟出,放入自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室待測。

    1.1.2 土柱處理 將取回的土柱放入體積約為450 mL、帶有換氣孔的玻璃瓶中,用50 mL注射器通過橡皮塞抽出 35 mL 的氣體(約為放入樣品之后剩余體積的10%),同時充入同體積的純C2H2氣體。培養(yǎng)36 h后用氣相色譜儀測量C2H4的生成量。每個樣品重復(fù)3次。

    1.1.3 根系、根際土、根外土和空白處理 將植物的根系(完全去除根表面土壤)、根際土(根表面5 mm內(nèi)土壤)、根外土(距根系較遠(yuǎn),根系影響不到的地方)與空白對照放入體積約為35 mL試管中,用膠塞封閉試管口,用5 mL注射器通過橡皮塞抽出2 mL氣體(約為放入樣品之后剩余體積的10%),同時充入同體積的純C2H2氣體,每個樣品做3個重復(fù)。培養(yǎng)24 h后用氣相色譜儀測量C2H4濃度,并換算成1 g樣品1 h內(nèi)乙烯生成量。

    1.2 培養(yǎng)基

    Dobereiner改良無氮培養(yǎng)基配方:蔗糖5.0 g、甘露醇5.0 g、蘋果酸5.0 g、乳酸鈉0.5 mL、K2HPO4·H2O 0.1 g、KH2PO4·H2O 0.4 g、NaCl 0.1 g、FeCl3 0.01 g、NaMoO4 0.002 g、MgSO4·7H2O 0.2 g(單獨(dú)滅菌)、CaCl2·2H2O 0.02 g(單獨(dú)滅菌),用蒸餾水補(bǔ)足至1 000 mL,調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.2。

    1.3 固氮菌的分離與測定

    分別準(zhǔn)確稱取10 g香蒲、白茅的根系(表面帶有土壤)于無菌研缽中,加無菌水研磨成糊狀,轉(zhuǎn)移定容至100 mL;繼續(xù)稀釋制成系列稀釋樣品,空白土壤直接梯度稀釋,分別從10-4、10-5稀釋液中取0.1 mL均勻涂布在Dobereiner改良無氮培養(yǎng)基平板上,28 ℃倒置培養(yǎng),2 d后計(jì)數(shù)。挑取單菌落劃線純化后,保存。

    分離得到的菌株用乙炔還原法確定其是否具有固氮活性,具體操作將分離得到的菌株接種到裝有5 mL Dobereiner改良無氮培養(yǎng)基的試管斜面中培養(yǎng)1 d后,將試管剩余空間的10%置換為C2H2(約為2 mL)后換上膠塞封閉試管口,于 28 ℃ 培養(yǎng)1 d后,用氣相色譜儀測定其固氮活性。

    1.4 測定方法

    1.4.1 固氮活性測定方法 采用乙炔還原法測定聯(lián)合固氮活性[7]。采用Agilent GC7890A氣相色譜儀,檢測器為FID檢測器,毛細(xì)管柱子型號:PLOT SILICAPLOT 30×32;測定樣品[用1 mL試管抽取0.5 mL氣體和標(biāo)氣(乙烯標(biāo)氣濃度為49 mg/L]中C2H4的峰面積。

    計(jì)算樣品固氮活性公式:

    NA=A1A2×C×V×122.4×1t×1S×273273+T×P760。

    式中:NA為C2H4氣體的生成速率,mmol/(m2·h);A1為樣品中C2H4的峰面積;A2為標(biāo)氣中C2H4的峰面積;C為C2H4標(biāo)氣的濃度;V為培養(yǎng)起的體積,L;t為培養(yǎng)時間;S為樣品的垂直投影面積,m2;T為向培養(yǎng)器中注入C2H2氣體時的環(huán)境溫度,℃;P為向培養(yǎng)器中注入C2H2氣體時的大氣壓,mmHg。

    1.4.2 理化性狀測定 pH值、尾礦土壤全氮含量、有效磷含量、有效鉀含量按《土壤理化分析》中描述的方法[8]測定。全銅含量采用國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法[9]測定。

    腐殖質(zhì)碳含量的測定:由于銅礦尾礦中含有大量金屬硫化物(即S2-),不能用重鉻酸鉀法直接測定,而改用焦磷酸鈉-氫氧化鈉浸提重鉻酸鉀法測定[7]腐殖質(zhì)含碳量。

    1.4.3 總DNA提取 使用天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(目錄號DP302-02)對固氮菌基因組DNA進(jìn)行提取,最后用TE緩沖液溶解DNA至濃度為50~100 ng/μL,于-20 ℃保存。

    1.4.4 16S rDNA序列測定及分析 使用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F、1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列:27F,5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R,5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系為50 μL,組成:32.75 μL滅菌超純水,5 μL 10×buffer,5 μL BSA,4 μL dNTP,27F、1492R引物各1 μL,0.25 μL rTaq酶,1 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,64 ℃ 1 min,-0.5 ℃/循環(huán),72 ℃ 1 min,32個循環(huán);72 ℃ 20 min。

    擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后,確定目的條帶單一,即送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定。使用EzTaxon server 2.1基因庫對測序序列進(jìn)行比對,并下載相近的序列;然后使用CLUSTAL X軟件進(jìn)行對比分析[10];最后用MEGA version 4.1[11]將測序得到的序列和基因庫已知的相近序列,以Kimura 2-Parameter為模型,采用鄰近法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 理化性狀

    尾礦土壤理化性質(zhì):pH值7.9,銅含量1 675.53 mg/kg,鉻含量79.93 mg/kg,鉛含量476.71 mg/kg,全氮含量 0.28 mg/kg,速效磷含量0.48 mg/kg,速效鉀含量 49.98 mg/kg,腐殖質(zhì)碳含量0.73 mg/kg。尾礦土壤中銅含量為1 675.53 mg/kg,嚴(yán)重超出400 mg/kg 的GB 15618—1995《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》三級標(biāo)準(zhǔn),這與鳳凰山的林沖尾礦庫的礦砂主要來自銅礦有關(guān)。尾礦裸露地土壤的全氮含量為 0.28 mg/kg,而當(dāng)土壤全氮含量在0.03%~0.08%范圍內(nèi),就很難滿足植物正常生長的需求。植被的枯枝落葉是土壤有機(jī)質(zhì)的主要來源,尾礦土壤腐殖質(zhì)碳含量主要與尾礦表層上的植被狀況有關(guān),導(dǎo)致裸露地的腐殖質(zhì)炭含量較低,僅為 073 mg/kg。表明尾礦土壤環(huán)境惡劣,不利于植物的定居生長。

    2.2 固氮活性

    2.2.1 土柱固氮活性 用乙炔還原法測定香蒲、白茅根際土柱,空白、結(jié)皮土柱(尾礦不同部位土柱)的固氮活性,測定結(jié)果見圖1。

    由圖1可見,尾礦廢棄地不同部位土柱都具有一定的固氮活性,固氮活性范圍在0.09~32.43 μmol/(m2·h),不同樣品有明顯差異。香蒲、白茅根際土柱固氮活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于結(jié)皮 1.30 μmol/(m2·h) 和空白0.09 μmol/(m2·h)。2種植物白茅、香蒲的根際土柱固氮活性相差很大,濕生植物香蒲的固氮活性可以達(dá)到32.43 μmol/(m2·h),而陸生植物白茅僅有19.27 μmol/(m2·h),表明濕生地更有利于植物根際聯(lián)合固氮作用。在結(jié)皮和空白土柱樣品中也測到固氮活性,但明顯低于植物根際固氮活性。認(rèn)為在尾礦環(huán)境中存在可以自由固氮的微生物。尾礦結(jié)皮固氮活性低于沙漠生物結(jié)皮的固氮活性[12],與尾礦理化性質(zhì)比沙漠更加惡劣有關(guān)。有研究表明,固氮活性受水分的影響[12],在一定水分范圍內(nèi),固氮活性隨著水分的增加而增高,本研究結(jié)果也表現(xiàn)出相同趨勢(圖2)。

    2.2.2 根際不同部位固氮活性 為了進(jìn)一步確定植物聯(lián)合固氮活性的差異,用乙炔還原法測定植物根際不同部位(根系、根際土、根外土)的固氮活性的大小,測定結(jié)果見圖3。

    由圖3可見,香蒲、白茅根際不同部位固氮活性都有相同變化趨勢,即根系>根際土>根外土,這可能與不同部位有機(jī)

    物含量有關(guān),即有機(jī)物含量極度貧乏的尾礦原生環(huán)境中,有機(jī)物含量越高,固氮活性就越高,反之亦然。尾礦中有機(jī)物主要來源植物根系分泌物、根系老化組織的脫落物[13],含量分布以根系為中心向外依次降低,這種變化趨勢與植物根際不同部位固氮活性變化趨勢相一致。香蒲根系和根際土的固氮活性均大于白茅,表明尾礦植被固氮活性與植物種類有關(guān)。植物生長發(fā)育過程中不斷地向根際土壤釋放有機(jī)物(如根系分泌物、表皮脫落物、根系死亡殘體等),不同種類植物及不同生育進(jìn)程,植物向根際釋放的有機(jī)物化學(xué)組分及總量會不盡相同,這決定了根際微生物的選擇性分布,也就是說不同植物種類及其生育進(jìn)程可以影響根際聯(lián)合固氮。香蒲和白茅的土柱固氮活性也反映這一點(diǎn)。

    2.3 固氮菌數(shù)量

    針對香蒲、白茅根際及未生長植物的裸露土壤(空白)進(jìn)行固氮菌的分離,分離結(jié)果見圖4。尾礦裸露土壤、白茅根際和香蒲根際都能分離到固氮菌,數(shù)量在8.42×105~2.27×106個/g干質(zhì)量之間。香蒲、白茅的固氮菌的數(shù)量(×106數(shù)量級)略高于空白樣品中的固氮菌的數(shù)量(×105數(shù)量級)。這與植物根際有機(jī)物濃度高于空白有關(guān)。尾礦固氮微生物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常土壤微生物數(shù)量(×108數(shù)量級)[14],表明尾礦極端生境不利于微生物的生長。香蒲、白茅的固氮活性卻相差很大,香蒲、白茅根際固氮菌的數(shù)量相差不大(×106數(shù)量級),至少表明可分離的固氮菌數(shù)量不是影響根際聯(lián)合固氮活性的主要因素。

    2.4 固氮菌菌株種類及固氮活性

    對分離得到的21株菌株用乙炔還原法測定其固氮活性。結(jié)果共得到12株具有固氮活性的菌株,分析結(jié)果見表1。ATWG1、ATWG2、ATWG3號3株菌株在所有樣品中都存在,具有普遍性。而ATWG8、ATWG9號2株菌株只在香蒲樣品中存在,ATWG5號菌株只在白茅樣品中存在,具有專一性。12株

    菌株固氮活性在7.15~3 416.98 nmol/(mL·h),不同菌株的固氮活性差異很大。固氮活性最高和最低之間相差了近478倍。從白茅樣品中分離的ATWG5號菌株、香蒲中分離的 ATWG9 號菌株固氮活性遠(yuǎn)高于何福恒等從水稻、玉米、甘蔗根際分離獲得的固氮菌活性[分別為2~819、880~894、299~934 nmol/(mL·h)][15],也高于田宏等從草坪草根際分離的固氮菌活性[37.78~180.20 nmol/(mL·h)][16]、田穎等從小麥根際分離的固氮菌活性[30.14~100.77 nmol/(mL·h)][17],表明白茅根際分離得到的ATWG5號固氮菌株、香蒲根際分離得到的ATWG9號固氮菌株具有較高固氮活性。尾礦先鋒植物根際聯(lián)合固氮,歸根到底是根際固氮菌與其周圍環(huán)境共同作用的結(jié)果,固氮菌是內(nèi)因。固氮菌活性的大小可以影響植物根際聯(lián)合固氮能力的大小。從香蒲樣品中分離得到1株高固氮活性的菌株也說明了這點(diǎn)。

    對菌株的固氮活性用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,可以得出ATWG1、ATWG5、ATWG8、ATWG9、ATWG10 5種菌株固氮活性差異顯著。

    2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

    對具有高固氮活性的2株菌株ATWG5、ATWG9進(jìn)行總DNA提取、PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定,用EzTaxon server 2.1基因庫對測序序列進(jìn)行比對,并下載相近的序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    在EzTaxon server 2.1基因庫選取與ATWG5號菌株同源性最近的3株菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),從圖5可以看出,ATWG5號菌株與Azorhizobium caulinodans親源關(guān)系最近,16S rDNA序列同源性為100%。研究發(fā)現(xiàn),Azorhizobium caulinodans與長喙田菁(Sesbania rostrata)共生,既可以形成根瘤,又可以形成莖瘤,具有較高的固氮活性[18]。

    在EzTaxon server 2.1基因庫選取與ATWG9號菌株同源性最近的4株菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。從圖6可以看出,ATWG9號菌株雖然單獨(dú)為1支,但是與Klebsiella oxytoca親源關(guān)系最近,16S rDNA序列同源性為98.75%。李樹品等從小麥根系分離得到產(chǎn)酸克雷伯菌,并通過乙炔還原法證明其具有高固氮活性[19]。

    3 結(jié)論與討論

    林沖尾礦不同部位都具有生物固氮活性,固氮活性大小為香蒲>白茅>結(jié)皮>空白,尾礦不同部位的固氮作用,有效提高了銅尾礦表層基質(zhì)的總氮含量,有利于后期植物生長。尾礦先鋒植物不同部位固氮活性大小為根系>根際土>根外土,表明植物根系是植物重要的固氮部位,根際的生物固氮,對尾礦的先鋒植物固氮有效性最直接。

    從植物根際分離得到的固氮菌數(shù)量明顯高于裸露土壤,但小于正常土壤的微生物含量。從尾礦不同部位樣品中共分離12株具有固氮活性的菌株,固氮活性范圍在7.15~3 416.98 nmol/(mL·h);植物種類影響了固氮菌的選擇性分布,這些固氮菌固氮直接參與植物的聯(lián)合固氮作用,進(jìn)而影響植物聯(lián)合固氮活性。

    針對2株高活性菌株進(jìn)行16S rDNA測序比對表明,ATWG5 號菌株與Azorhizobium caulinodans親緣關(guān)系最近,相似性達(dá)到100%,ATWG9號菌株與Klebsiella oxytoca親源關(guān)系最近,相似性達(dá)到98.75%。

    在氮素極其匱乏的尾礦極端環(huán)境中,優(yōu)勢先鋒植物主要是非豆科植物,這些先鋒植物并不能進(jìn)行類似豆科植物共生固氮作用,只能進(jìn)行聯(lián)合固氮作用,為植物提供生長所必需的氮素。而植物聯(lián)合固氮作用歸根到底是聯(lián)合固氮微生物的作用,固氮微生物與宿主植物有密切關(guān)系。有研究表明,不同聯(lián)合固氮菌的固氮活性有明顯差異,相差幾十倍甚至更多[20],本研究結(jié)果也證明了這點(diǎn)。在本研究中,可以得出尾礦先鋒植物的固氮活性不同,根際固氮微生物的數(shù)量不盡相同;同時也得出不同植物根際固氮微生物的種類也不盡相同,不同固氮微生物的固氮活性差異很大。固氮微生物這種數(shù)量活性的差異共同影響了植物的聯(lián)合固氮作用。然而,關(guān)于固氮微生物對宿主植物聯(lián)合固氮活性的影響機(jī)理還須進(jìn)一步研究。

    在尾礦自然條件下,先鋒植物存在聯(lián)合固氮菌株,但是相對于龐大的根際微生物來說其種群數(shù)量較少,與其他微生物競爭力有限,固氮量甚微[21]。對于尾礦生態(tài)修復(fù),可以將來源于尾礦先鋒植物根際的高效固氮菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),以接種劑的形式施入先鋒植物根際,提高根際固氮菌種群數(shù)量,增強(qiáng)群競爭力,增加根際微生物固氮總量。本研究獲得的固氮菌菌株大多數(shù)生長速度較快,在土壤中存活定居可能性大,將這些固氮菌株應(yīng)用于尾礦的生態(tài)修復(fù)具有良好應(yīng)用前景。

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