高效固氮花生根瘤菌株的篩選

劉瑞瑞　危期　劉夢函

摘要：以采自河北省保定市淶水縣的花生根瘤為原材料，進行花生根瘤的采集、菌株分離純化和回接試驗，通過研究接種不同根瘤菌菌株對天府3號花生生長的影響，成功篩選出可與該種花生高效固氮的優(yōu)良菌株。研究結(jié)果表明：接種Hbu074005菌株效果最佳，花生植株干質(zhì)量較對照組提高52.29%，其結(jié)瘤數(shù)、果穗數(shù)、植株株高等指標也明顯優(yōu)于對照組及其他處理，分別較對照提高235.56%、112.00%、31.31%；菌株Hbu074012、Hbu074004的表現(xiàn)僅次于Hbu074005，干質(zhì)量分別較對照提高43.13%、35.88%。由結(jié)果可以看出，菌株Hbu074005可顯著提高天府3號花生的生產(chǎn)性狀，是較為優(yōu)良的花生高效共生固氮菌株。研究結(jié)果為高效固氮根瘤菌在花生農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，具有一定的現(xiàn)實生產(chǎn)意義。

關(guān)鍵詞：花生；根瘤菌；高效固氮；盆栽試驗

中圖分類號： S182；S154.39 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0472-04

花生（Arachis hypogaea）別稱落花生、番豆、地豆、長生果，屬豆科落花生屬，為1年生草本植物，是中國主要的油糧兩用作物。2012年，中國花生播種面積為470萬hm2，產(chǎn)量居油料作物首位，占世界花生產(chǎn)量的40.8%[1]?；ㄉ缓鞍踪|(zhì)、脂肪等多種營養(yǎng)成分，且供給相對均衡，是目前較為理想的種植作物，具有良好的經(jīng)濟價值和藥用價值[2]?；ㄉ释ǔＳ米魇秤糜吞崛〉脑牧?，花生油脂在紡織、印染工業(yè)上可用作乳化劑、潤滑劑，為工業(yè)生產(chǎn)提供便利[3]。相關(guān)研究證實，花生根莖中含有豐富的白藜蘆醇[4-5]。白藜蘆醇是一種良好的植物抗菌素，具有抗氧化、抗腫瘤、保護心血管的作用，被喻為繼紫杉醇之后又一新的綠色抗癌藥物[6-7]。目前，白藜蘆醇的產(chǎn)量遠不能滿足醫(yī)藥市場的需求，開發(fā)花生根莖白藜蘆醇生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)具有重大的醫(yī)藥用價值和深遠的社會意義。我國花生多種植在遼東半島、山東半島、東南沿海地區(qū)以及黃河、長江流域的部分地區(qū)。與其他常規(guī)作物相比，花生具有強抗逆、耐瘠薄、適應(yīng)性強、生產(chǎn)效益高的特點。在能源短缺和環(huán)境危機日益嚴峻的社會背景下，花生殼、花生枝條等自然狀態(tài)下的生物質(zhì)可以通過生物轉(zhuǎn)換和熱化學(xué)交換制備焦油、焦炭、液態(tài)燃料等，即可用作能源，又可作為化工原料。相關(guān)研究報道，1 t花生油下腳料可以轉(zhuǎn)化為近1 t的生物柴油，這種利用花生油下腳料轉(zhuǎn)化的生物柴油與傳統(tǒng)柴油相比不含對人體有害的硫和苯，燃燒后污染物排放量減少50%，是一種綠色、清潔、可再生的能源[8]。因此，花生作為一種生物質(zhì)新能源必將得到更快更好的發(fā)展[9]。近年來，許多國家在擴大豆科植物的生產(chǎn)面積，但在實際生產(chǎn)中過分依賴化學(xué)合成肥料，使得土壤中氮磷單一養(yǎng)分過高，造成土壤板結(jié)，土壤養(yǎng)分失調(diào)[10]。并且化肥施用會導(dǎo)致土壤和水污染等一系列環(huán)境問題的產(chǎn)生。在化肥零增加的政策下，如何提高作物產(chǎn)量并保良土壤是我們面臨的一個重要課題。

根瘤菌與豆科植物共生是生物固氮作用最強的體系，所固定的氮約占生物固氮總量的65%[11-12]。然而豆科植物與根瘤菌共生具有較強的專一性，新種植的土壤中有效根瘤菌的數(shù)量往往很少，固氮效率低，必須接種高效固氮根瘤菌才會顯示固氮生長優(yōu)勢[13]，因此，人工接種優(yōu)良菌株可以充分發(fā)揮固氮作用，提高作物產(chǎn)量[14-15]。豆科植物與根瘤菌共生固氮優(yōu)良組合篩選一直是生物固氮研究領(lǐng)域中的熱點[16-18]。有關(guān)花生根瘤菌的研究表明，不同自然環(huán)境中的花生根瘤菌遺傳多樣性差異明顯[19-20]，花生根瘤菌菌種的多樣性，為花生的增產(chǎn)提供了理想豐度的菌種資源庫。我國目前對于豆科植物根瘤菌應(yīng)用的研究很多[21-23]，對花生根瘤菌的研究也已卓見成效。周平貞等對我國各省接種花生根瘤菌的增產(chǎn)作用進行了分析總結(jié)，其平均增產(chǎn)率可達13.4%，其中接種凍干菌劑與草炭菌劑分別可增產(chǎn)38.0%、45.4%[24]。近年來，吳海燕等已經(jīng)篩選出了適合吉林省、四川省花生品種的優(yōu)良菌株[25-26]。目前，河北省優(yōu)良花生根瘤菌選育的研究報道較少，劉杰等分析表明，河北地區(qū)花生根瘤菌具有更大的多樣性[27]。本研究以采自河北省保定市淶水縣花生根瘤為試驗材料，通過分離純化得到根瘤菌純培養(yǎng)物，進行回接試驗，篩選并保存生產(chǎn)性狀優(yōu)良的根瘤菌菌株，為實現(xiàn)花生增產(chǎn)、減少土壤污染、培肥地力、改善生態(tài)環(huán)境奠定了理論基礎(chǔ)，并具有一定的生產(chǎn)價值和社會意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及分離

以河北省保定市淶水縣婁村滿族鄉(xiāng)為采集地點，進行天府3號花生根瘤的采集。

選取飽滿根瘤若干，無菌水沖洗干凈后用95%乙醇浸泡處理5 min，5% NaClO浸泡處理1 min，然后用無菌水沖洗 5～6次，以充分洗去殘留的消毒液；將消毒后的根瘤置于無菌培養(yǎng)皿中，用無菌竹簽壓破根瘤，使根瘤內(nèi)容物流出，用接種環(huán)蘸取根瘤汁液在YMA固體平板上劃線，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d，直至長出單菌落。從平板上挑選圓形、光滑有光澤、邊緣整齊、稍有突起的具有典型根瘤菌菌落形態(tài)特征的單菌落，革蘭氏染色鏡檢。選取革蘭氏染色陰性、細胞形態(tài)桿狀的培養(yǎng)物進行純化。純化后接種于YMA斜面，4 ℃存放備用，并轉(zhuǎn)接于含20%甘油的YMA液體培養(yǎng)基中，-80 ℃保存。

1.2 高效菌株的土壤篩選

1.2.1 土壤 采用滄州黃驊鹽堿土，并添加10%沙作為土壤基質(zhì)。將土壤壓碎去雜，按照鹽堿土 ∶ 沙=9 ∶ 1的比例充分混勻，稱取1.0 kg置于種植花盆中，種植前適量澆水，保持土壤濕潤。

1.2.2 種子催芽 選用天府3號花生品種，取光滑飽滿、粒大的花生種子。將種子依次用95%乙醇浸泡處理5 min，5% NaClO浸泡處理1 min，然后用無菌水沖洗5～7次進行消毒。將消毒后的種子均勻置于墊有濕潤濾紙的150 mm直徑培養(yǎng)皿中，26～30 ℃黑暗避光生長。

1.2.3 接種與培養(yǎng) 待芽長至1 cm左右，挑選長勢好的發(fā)芽花生，每5個1組放入滅菌培養(yǎng)皿中，加入2 mL菌液，侵染30 min后植入花盆進行土壤篩選試驗，用塑料薄膜封閉盆口（待幼苗長出時將薄膜劃開）。每個處理設(shè)5個重復(fù)，以不接菌為空白對照。將接種后的花生轉(zhuǎn)入28 ℃、光照時間12 h的溫室，隨機排列放置，根據(jù)花盆失水狀況定期澆水。

1.2.4 作物生長指標的采集 培養(yǎng)至40 d可觀察到植物開花，培養(yǎng)至85 d時開始觀測結(jié)果，觀測項目包括植株株高、結(jié)瘤數(shù)、果穗數(shù)及地上部分干質(zhì)量（以第1張葉葉痕處為劃分標準，植物樣品先在烘箱中于105 ℃殺青2 h，然后于65 ℃烘干至恒質(zhì)量）。篩選出性能優(yōu)良的菌株繼續(xù)回接2～3次，得到重復(fù)性好的穩(wěn)定菌株。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

YMA固體培養(yǎng)基：KH2PO4 0.25 g，K2HPO4 0.25 g，NaCl 0.1 g，甘露醇10 g，酵母粉0.8 g，瓊脂14 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，蒸餾水1 L，pH值6.5～7.0。試劑：革蘭氏染液、無菌水、95%乙醇、5% NaClO。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)通過SPSS 13.0進行單因素方差分析，在滿足方差分析的情況下，利用Tukey檢驗進行多重比較，確定各因子水平內(nèi)部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 根瘤菌的分離與培養(yǎng)

通過對根瘤樣品的分離、純化，共得到花生根瘤菌菌株19株，從表1可以看出，接種根瘤菌菌株對花生植株株高、干質(zhì)量、結(jié)瘤數(shù)、果穗數(shù)均有顯著影響，這可能是花生接種根瘤菌后，與其匹配的菌株提高了花生的氮素營養(yǎng)水平，從而為花生后期的生長發(fā)育和產(chǎn)量提高打下基礎(chǔ)。

2.2 根瘤菌對花生生長及產(chǎn)量的影響

花生接種根瘤菌85 d后收獲，測定植株株高、干質(zhì)量、結(jié)瘤數(shù)、果穗數(shù)等。通過對接種不同根瘤菌菌株的作物進行單因素方差分析，通過均值分析，獲得花生植株干質(zhì)量、結(jié)瘤數(shù)、株高等生長性狀（表2）。

從表2可以看出，接種不同的根瘤菌均能增加花生植株株高及干質(zhì)量，說明施用根瘤菌肥能明顯促進花生的營養(yǎng)生長[28]，增加其生物量及干物質(zhì)積累量。不同的菌株對花生的促進作用存在差別，說明根瘤菌與植物之間共生固氮存在一定的匹配性。所有供試菌株中，對干質(zhì)量影響較大的菌株依次順序為Hbu074005、Hbu074012、Hbu074004，分別比對照高52.29%、43.13%、35.88%，且這3株菌株均與對照組差異顯著。接種不同根瘤菌對花生植株株高也表現(xiàn)出促進作用，與對照相比，試驗組花生株高均有不同程度的增加。影響較大的菌株依次為Hbu074017、Hbu074005、Hbu074014，分別較對照提高31.65%、31.31%、29.59%，其中菌株Hbu074005、Hbu074017與其他多數(shù)菌株差異顯著。對結(jié)瘤數(shù)影響較大的 接種根瘤菌的處理組果穗數(shù)均較對照有不同程度的增加。且接種不同的花生根瘤菌對花生產(chǎn)量性狀的影響不同，相互間差異較大。接種表現(xiàn)較好的處理為Hbu074004，果穗平均為12.0個，較對照組提高140.0%；接種菌株Hbu074005、Hbu074012的花生果穗數(shù)分別較對照組提高112.0%、84.0%。表明接種根瘤菌可以明顯提高豆科作物花生的產(chǎn)量和品質(zhì)。

對接種表現(xiàn)較好的處理進行植株干質(zhì)量方差分析，結(jié)果見圖1。綜合各項指標分析，所有處理中以菌株Hbu074005總體效果最好，其次為菌株Hbu074012、Hbu074004。菌株Hbu074017的結(jié)瘤數(shù)、株高增加顯著，但其干質(zhì)量卻僅比對照增加16.79%，原因有待分析。

2.3 接種根瘤菌Hbu074005對花生生長狀況的影響

花生接種根瘤菌Hbu074005后，植株莖稈粗壯，分蘗數(shù)多，生長旺盛，產(chǎn)量性狀也有明顯的提高（圖2）。對照組中，花生植株莖稈稍細，長勢較弱，果穗數(shù)也低于試驗組。

3 討論與結(jié)論

花生是我國主要的油、糧兩用作物，在我國廣泛種植?；ㄉ嵌箍浦参铮箍浦参锏拇竺娣e栽培需要人工接種根瘤菌。陳文新提到，在一個地區(qū)，如果從未種植過或5年以上沒有種過某種豆科植物，土壤中很難有與該種豆科植物相匹配的土著根瘤菌[13]。因此在少施氮肥的條件下，如果沒有有效的共生根瘤菌進行結(jié)瘤固氮給植物提供營養(yǎng)，植物很難在該地實現(xiàn)高產(chǎn)，因此對高效固氮根瘤菌株的篩選具有重要意義。

本研究篩選了3株優(yōu)良的根瘤菌菌株Hbu074005、Hbu074012、Hbu074004，其干質(zhì)量及其他生長指標都較為理想。具有最大結(jié)瘤數(shù)的菌株Hbu074005同時具有最大干質(zhì)量，在其他處理中干質(zhì)量與結(jié)瘤數(shù)呈正相關(guān)。說明接種合適的根瘤菌能夠顯著提高花生的結(jié)瘤能力，增加植株的生物量和含氮量，對花生生長發(fā)育具有明顯的促進作用和增產(chǎn)效應(yīng)，林國林等研究也證明了這一點[29]。劉曉云等研究表明，來源相同的菌株接種后測試指標差異很大，表明土著菌經(jīng)過篩選后是可以得到高效菌株的[30]；鐘文文等也已利用分子標記技術(shù)從土著菌中成功篩選出與盛世苜蓿相匹配的高效苜蓿根瘤菌菌株[31]。

研究中發(fā)現(xiàn)，接種菌株Hbu074004后，植株干質(zhì)量及株高較對照明顯增加，但結(jié)瘤數(shù)提升并不顯著，說明僅依靠結(jié)瘤數(shù)指標不能準確判斷菌株固氮能力的高低，結(jié)瘤是一個耗能的過程，結(jié)瘤數(shù)過多會給植物增加一定的負擔。此外，接種菌株Hbu074017后花生地上部分生長旺盛，株高、分蘗數(shù)較對照有顯著差異，根部結(jié)瘤數(shù)比較顯著，但植物的干質(zhì)量貢獻較其他指標低，果穗數(shù)也較少并且發(fā)育不成熟。因此篩選高效菌株，結(jié)瘤數(shù)可作為一個參考指標。

綜合考慮各項指標，菌株Hbu074005對天府3號花生具有較高的固氮效率，可明顯促進其生長發(fā)育，可作為進行天府3號花生種植時匹配的根瘤菌菌株。

本研究選用鹽堿土作為土壤基質(zhì)。河北地區(qū)鹽堿耕地較多，其中絕大多數(shù)屬于中、低產(chǎn)田，若能被充分利用，將是非常寶貴的土壤資源。在鹽堿地區(qū)種植豆科作物，可通過豆科植物與根瘤菌共生作用，使植物獲得生長所需的大部分氮素，同時可以增加土壤中微生物的豐富度，明顯改善土壤的營養(yǎng)狀況。本研究應(yīng)用鹽堿土篩選所獲得的高效菌株，可用于鹽堿地的花生種植栽培，具有較好的現(xiàn)實意義。

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