地塞米松促進(jìn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒致病性

王永娟　朱善元　劉博

摘要：為檢測地塞米松對豬感染PRRSV后免疫力及致病性的影響，將6頭健康豬平分為2組，分別注射地塞米松和生理鹽水，連續(xù)注射3 d。檢測注射前、注射后1周的PRRSV抗體陽性率及病毒量，觀察并記錄體溫、呼吸、飲食、眼結(jié)膜、糞便等臨床情況。結(jié)果顯示，豬的PRRSV抗體陽性率為100%，但注射后的抗體值高于注射前；病毒蛋白半定量結(jié)果顯示病毒感染量顯著增加；注射地塞米松組的豬表現(xiàn)出一定臨床癥狀，而對照組未發(fā)生變化。結(jié)果表明，地塞米松會增加PRRSV的發(fā)病風(fēng)險，為建立防治PRRSV感染的動物模型奠定了基礎(chǔ)，為獸醫(yī)臨床中合理使用糖皮質(zhì)激素類藥物提出新的要求。

關(guān)鍵詞：糖皮質(zhì)類激素；地塞米松；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；致病性

中圖分類號： S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0293-02

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）廣泛存在于各養(yǎng)殖場，可引發(fā)免疫逃避，呈帶毒但不發(fā)病、條件性致病狀態(tài)[1]。發(fā)病時表現(xiàn)為PRRSV與其他病原同時存在，呈繼發(fā)或并發(fā)感染[2]。病豬的臨床癥狀變化較大，通常出現(xiàn)體溫升高、食欲下降、氣喘咳嗽、肢體末端瘀血、共濟(jì)失調(diào)、運動減少、精神狀態(tài)不佳等癥狀，死亡率達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率達(dá)30%以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[3-4]。PRRSV抗體產(chǎn)生較早，但初始1周內(nèi)產(chǎn)生的抗體不具有中和作用，僅能作為一種指示性抗體用于病毒感染的早期檢測；中和抗體產(chǎn)生比較緩慢，一般于病毒感染后1～2個月出現(xiàn)[5]。

地塞米松為代表性糖皮質(zhì)激素類藥物，對抗炎、免疫抑制、抗內(nèi)毒素、抗休克、影響代謝具有顯著作用[6-10]，在獸醫(yī)臨床中被廣泛應(yīng)用于治療母畜代謝病，或與抗生素聯(lián)合用于治療感染性疾病。有報道表明，地塞米松等糖皮質(zhì)激素可上調(diào)PRRSV受體的表達(dá)[11]，促進(jìn)PRRSV感染或致病。擬將地塞米松注射于健康豬，通過臨床癥狀、標(biāo)志性抗體、病毒量等方面摸索開展PRRSV試驗感染的條件，為建立防治PRRSV感染的動物模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。地塞米松（國藥準(zhǔn)字H41020036）由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物實習(xí)醫(yī)院提供。RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、Taq DNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、瓊脂糖、病毒RNA提取試劑盒均購自美國Promega公司。

1.2 試驗動物

30日齡健康仔豬購自江蘇省如皋市某規(guī)?；B(yǎng)殖豬場。

1.3 豬群PRRSV抗體檢測

在如皋市某豬場選取10頭未發(fā)病的30日齡仔豬，無菌采血并分離血清，按照豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測試劑盒使用說明書檢測抗體水平，分別讀取D450 nm，每個血清樣品做2個重復(fù)。按照該試劑盒的判斷標(biāo)準(zhǔn)，被檢血清平均吸光值（S）/標(biāo)準(zhǔn)陰性血清平均吸光值（N）值≥2.40判為陽性，<2.40判為陰性。

1.4 適應(yīng)性飼養(yǎng)與藥物注射

根據(jù)S/N值判斷仔豬的PRRSV抗體陽性率，選擇其中讀值較低的6頭豬，分別稱其質(zhì)量，用耳號鉗標(biāo)記，適應(yīng)性飼養(yǎng)于經(jīng)氯仿消毒的畜舍。3 d后，將1～3號豬作為地塞米松注射組，按0.067 mg/kg的劑量進(jìn)行肌肉注射，每天09：00、15：00各1次，連續(xù)注射3 d；將4～6號豬作為生理鹽水注射組（陰性對照）。

1.5 臨床癥狀觀察

自注射地塞米松1 d起每天觀察并記錄食欲、精神狀態(tài)、皮膚、呼吸、眼結(jié)膜、體溫、糞便等臨床癥狀，連續(xù)觀察7 d。

1.6 試驗豬PRRSV抗體檢測

于停止注射1周后無菌采集豬血并分離血清，按照“1.3”節(jié)的抗體檢測方法分別測定6頭豬的D450 nm。

1.7 病毒半定量測定

根據(jù)GenBank已公布的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）、低致病性PRRSV（LP-PRRSV）的Nsp2基因序列，分別設(shè)計能擴(kuò)增出400 bp或（和）264 bp的特異性上、下游引物，同時設(shè)計能擴(kuò)增出600 bp β-actin的上、下游引物[12]。于注射1周后采集6頭豬的唾液，按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取其總RNA，進(jìn)行Nsp2基因的半定量RT-PCR檢測，電泳后采用ND-1000型分光光度計進(jìn)行灰度掃描，根據(jù)各組Nsp2基因變化判斷病毒量。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬群PRRSV抗體

按照PRRSV抗體檢測試劑盒說明書，測得10頭未發(fā)病30日齡仔豬的PRRSV抗體D450 nm值（表1），根據(jù)該試劑盒的判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷10頭被檢豬的陽性率為100%，但是均未發(fā)病。

2.2 臨床發(fā)病記錄

按照D450 nm值由低到高的順序選擇6頭被檢豬進(jìn)行分組試驗，自注射地塞米松1 d起觀察每頭豬的臨床癥狀。結(jié)果顯示，生理鹽水注射組（對照組）未出現(xiàn)明顯臨床癥狀，地塞米松注射組（試驗組）的豬出現(xiàn)食欲下降、精神萎靡、皮膚瘀血、眼結(jié)膜潮紅、腹瀉癥狀。體溫記錄見圖1，呼吸數(shù)記錄（n=3）見圖2，試驗組的體溫與呼吸數(shù)于注射地塞米松3 d起開始升高。

2.3 試驗豬PRRSV抗體

于停止注射1周后測定豬的PRRSV抗體水平，D450 nm吸光值見表2。根據(jù)該試劑盒的判斷標(biāo)準(zhǔn)，判斷試驗豬的陽性率與注射前一致，均為100%，但注射組血清的吸光值明顯高于對照組血清。

2.4 病毒基因半定量測定

唾液樣品中病毒基因Nsp2的RT-PCR半定量檢測結(jié)果見圖3。6頭豬均為LP-PRRSV病毒感染，而無HP-PRRSV病毒感染，試驗組豬的病毒基因表達(dá)量比對照組提高3倍左右。

3 結(jié)論與討論

PRRSV病毒嗜好在肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）、肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞（PM）內(nèi)復(fù)制[13]，可在數(shù)小時至數(shù)天內(nèi)破壞大量巨噬細(xì)胞，造成肺、淋巴結(jié)的損傷，使其對異物的非特異性吞噬清除功能大幅降低，易繼發(fā)其他細(xì)菌或病毒感染[2]。已有研究表明，其他病原的協(xié)同感染往往可刺激PRRSV受體表達(dá)，從而使豬更易感染，這是PRRSV常與其他疾病同時存在的根本原因。自然狀態(tài)下的PRRSV復(fù)制不易成功，為在實驗室開展PRRS的攻毒保護(hù)試驗，有必要摸索PRRSV的感染條件。地塞米松等糖皮質(zhì)激素可上調(diào)PRRSV受體的表達(dá)[11]，理論上可模擬其他病原促進(jìn)PRRSV感染或致病。本研究選取感染PRRSV但未發(fā)病的豬為試驗動物，人為注射地塞米松，結(jié)果顯示地塞米松注射組的豬可在短時間內(nèi)出現(xiàn)典型的PRRS癥狀，且抗體水平及病毒量均明顯上升，而對照組未出現(xiàn)異常癥狀。結(jié)果表明，地塞米松可作為誘導(dǎo)劑增加豬感染PRRSV的風(fēng)險并引起發(fā)病，可為今后建立PRRSV相關(guān)研究的試驗動物模型奠定基礎(chǔ)。

動物模型的建立一般應(yīng)選擇SPF動物，在隔離條件下進(jìn)行試驗。鑒于PRRSV帶毒豬多、PRRSV抗體陰性豬場較少、SPF豬價格昂貴且運輸不便等試驗條件的限制，本試驗選取帶毒未發(fā)病仔豬，確保其他條件完全一致的情況下設(shè)立試驗組與對照組，從臨床癥狀、標(biāo)志性抗體、病毒量方面判斷地塞米松對PRRSV感染的影響，結(jié)果與預(yù)期一致，表明此方案具有可行性。

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