子囊菌門無性產(chǎn)孢brlA基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

胡珍珠　楊志輝　刁琢

摘要：無性產(chǎn)孢基因brlA在子囊菌產(chǎn)孢的中心調(diào)控通路中控制分生孢子梗的形成，brlA基因的激活是曲霉屬真菌產(chǎn)孢的一個(gè)關(guān)鍵步驟。以子囊菌門已測序的無性產(chǎn)孢brlA基因家族的60條核苷酸序列為材料，用鄰接法、最小進(jìn)化法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析該基因家族在子囊菌中的演化關(guān)系。結(jié)果表明：以brlA基因家族序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹共形成了穩(wěn)定的、高支持率的Ⅰ～Ⅳ共4個(gè)大分支；該系統(tǒng)發(fā)育樹又可細(xì)分為以子囊菌8個(gè)目為代表的8個(gè)小分支，即爪甲團(tuán)囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、肉座菌目（Hypocreales）、小叢殼目（Glomerellales）、糞殼菌目（Sordariales）、柔膜菌目（Helotiales）、散囊菌目（Eurotiales）。由結(jié)果可知，子囊菌門無性產(chǎn)孢brlA基因家族的演化與子囊菌高級分類階元目的演化相對應(yīng)，為子囊菌門不同類群間分生孢子梗演化學(xué)方面的研究提供可靠的分子證據(jù)。

關(guān)鍵詞：子囊菌門；無性產(chǎn)孢；brlA；基因家族；系統(tǒng)發(fā)育樹

中圖分類號： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0048-04

無性孢子的形成是大多數(shù)子囊菌最常見的繁殖方式，包括特定的細(xì)胞分化、基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]。分生孢子是高等真菌的無性孢子，對保持長期生存發(fā)育有重要作用[2]。

子囊菌門曲霉屬的分生孢子在分生孢子梗上形成[3]，分生孢子梗的形態(tài)是曲霉屬一個(gè)重要的分類學(xué)依據(jù)。構(gòu)巢曲霉分生孢子的形成在形態(tài)學(xué)上被分為幾個(gè)不同的階段[4]：首先是基細(xì)胞分支出氣生梗，然后梗的尖端開始腫脹形成多核囊泡；在囊泡表面形成2層小梗，分別是?；?、瓶梗；最后，瓶梗經(jīng)歷了重復(fù)的不對稱的有絲分裂，產(chǎn)生了分生孢子鏈。產(chǎn)孢的整個(gè)過程都是特定的，并且不同的基因組合在每個(gè)階段行使的功能不同[5]。

brlA、abaA、wetA這3個(gè)基因組成調(diào)控分生孢子特定基因表達(dá)的中心調(diào)控通路，并決定分生孢子梗形成、孢子成熟過程中基因激活的順序[6]。brlA基因的激活是曲霉屬產(chǎn)孢的一個(gè)關(guān)鍵步驟，brlA在從分生孢子梗極化的頂端生長到囊泡腫脹的轉(zhuǎn)型期是必需的[7]。敲除brlA的突變體形成剛毛狀的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生1個(gè)細(xì)長的梗，從而不能產(chǎn)生囊泡或者其他后續(xù)的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)[8]；相反，brlA在生長的細(xì)胞中超表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生長中斷，并且從菌絲尖端直接形成可育的分生孢子[9]。brlA有1個(gè)復(fù)合結(jié)構(gòu)，包含2個(gè)重疊的轉(zhuǎn)錄本brlAα、brlAβ，在分生孢子發(fā)育過程中起著不同的作用[10]。BrlA蛋白主要定位于囊泡或小梗上。AbaA是瓶梗分化的主要成分，在分生孢子發(fā)育中期階段被BrlA激活[11]。wetA基因在分生孢子形成的晚期被AbaA誘導(dǎo)，并且在使分生孢子成熟的過程中起重要作用[12]。

子囊菌門絕大多數(shù)都可產(chǎn)生無性的分生孢子，但是分生孢子的產(chǎn)生方式、形態(tài)有很大差別，而控制其產(chǎn)生的關(guān)鍵基因brlA基因家族在不同類群中的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系對揭示其孢子產(chǎn)生方式和形態(tài)的不同有重要價(jià)值，也為該基因家族基因的分子演化提供數(shù)據(jù)支撐。因此，本研究從GenBank中下載子囊菌門8個(gè)目的brlA基因家族的60條核苷酸序列，用鄰接法、最小進(jìn)化法構(gòu)建子囊菌門brlA基因家族高級分類階元的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 brlA基因的核苷酸序列

brlA基因的核苷酸序列來自GenBank數(shù)據(jù)庫，通過該數(shù)據(jù)庫下載子囊菌8個(gè)目中60條含有brlA基因的核苷酸序列，其中散囊菌目（Eurotiales）15條，爪甲團(tuán)囊菌目（Onygenales）9條，肉座菌目（Hypocreales）7條，格孢腔菌目（Pleosporales）8條，刺盾炱目（Chaetothyriales）、糞殼菌目（Sordariales）各6條，小叢殼目（Glomerellales）5條，柔膜菌目（Helotiales）4條（表1）。

1.2 序列分析

對所下載序列按照GenBank登錄號進(jìn)行重命名后，用MEGA 6軟件[13]中的ClustalW進(jìn)行比對后剪切。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用MEGA 6軟件[13]，采用鄰接法、最小進(jìn)化法對已剪切的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，bootstrap值重復(fù)1 000次，隱藏50%以下的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 brlA基因的系統(tǒng)發(fā)育分類

利用鄰接法、最小進(jìn)化法對brlA基因的核苷酸序列所構(gòu)建的2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。由鄰接法對核苷酸序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）可以看出，所構(gòu)建的子囊菌門無性產(chǎn)孢brlA基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹形成了4個(gè)高bootstrap值所支持的即Ⅰ～Ⅳ等大分支。其中，分支Ⅰ包括爪甲團(tuán)囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales），這2個(gè)目聚到一起的支持率為84%，都屬于散囊菌綱（Eurotiomycetes）；分支Ⅱ?yàn)橹С致蕿?9%的格孢腔菌目（Pleosporales）；分支Ⅲ包括肉座菌目（Hypocreales）、小叢殼目（Glomerellales）、糞殼菌目（Sordariales）、柔膜菌目（Helotiales）等4個(gè)目，除柔膜菌目屬于錘舌菌綱外，其余3個(gè)目均為糞殼菌綱；分支Ⅳ為散囊菌目（Eurotiales），單獨(dú)聚為1個(gè)支，屬散囊菌綱（Eurotiomycetes）。

而上述4個(gè)大分支又可劃分為以子囊菌門下所屬目為代表的8個(gè)末端小分支，即爪甲團(tuán)囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、肉座菌目（Hypocreales）、小叢殼目（Glomerellales）、糞殼菌目（Sordariales）、柔膜菌目（Helotiales）和散囊菌目（Eurotiales）（圖1）。

2.2 brlA基因家族演化與子囊菌演化間關(guān)系的分析

由文獻(xiàn)[14]可知，散囊菌目（Eurotiales）、爪甲團(tuán)囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）歸為散囊菌綱（Eurotiomycetes），肉座菌目（Hypocreales）、糞殼菌目（Sordariales）、小叢殼目（Glomerellales）歸為糞殼菌綱（Sordariomycetes），格孢腔菌目（Pleosporales）歸為座囊菌綱（Dothideomycetes），柔膜菌目（Helotiales）歸為錘舌菌綱（Leotiomycetes）。將子囊菌產(chǎn)孢相關(guān)基因brlA的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，該樹劃分為Ⅰ～Ⅳ4個(gè)大分支，而形成的8個(gè)小分支按子囊菌的8個(gè)目分類。分支Ⅰ包含的爪甲團(tuán)囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）均屬于散囊菌綱，且2個(gè)目聚到一起的支持率較高；爪甲團(tuán)囊菌目（Onygenales）中，還有1株散囊菌目的青霉菌XM_002560241也與之聚到了一起；分支Ⅱ以座囊菌綱中的格孢腔菌目為代表；分支Ⅲ包括的4個(gè)目中，除柔膜菌目屬于錘舌菌綱外，其余3個(gè)目均為糞殼菌綱；分支Ⅳ以散囊菌目為代表，聚成1個(gè)大分支。

由圖1可知，無性產(chǎn)孢brlA基因家族的演化關(guān)系與子囊菌高級分類階元的演化關(guān)系基本一致。形成的8個(gè)小分支中的每個(gè)分支分別以子囊菌的1個(gè)目為代表，且親緣關(guān)系較近的目聚到一起的支持率也較大。

3 結(jié)論與討論

在真菌中，子囊菌門是最大的1個(gè)門，呈現(xiàn)最廣泛、最復(fù)雜的分化現(xiàn)象。其中，無性產(chǎn)孢是一種主要的繁殖方式，對其產(chǎn)孢機(jī)制及相關(guān)基因的研究情況已有大量報(bào)道[15]。子囊菌門不同類群間所共有的brlA基因是其無性產(chǎn)孢過程中分生孢子梗形成階段所必需的基因，是保證子囊菌無性產(chǎn)孢順利進(jìn)行的內(nèi)在因素。

子囊菌門無性產(chǎn)孢brlA基因家族以目為代表的高級分類階元的brlA基因間存在巨大差異，而同一目不同種屬間的差異相對較小，這表明該基因在進(jìn)化過程中受到了與子囊菌門高級分類單元間類群分化的嚴(yán)重正選擇作用。但是也有例外，如本屬于散囊菌目的XM_002560241這株青霉菌與爪甲團(tuán)囊菌目聚到了 一起，且支持率高達(dá)82%，可能是由于散囊菌目、爪甲團(tuán)囊菌目同屬于散囊菌綱[14]。在子囊菌門更高分類階元綱的水平上，brlA基因家族的演化與其綱的目前分類系統(tǒng)沒有很明確的對應(yīng)關(guān)系，如散囊菌目與同屬于散囊菌綱的爪甲團(tuán)囊菌目、刺盾炱目未聚到一起，這值得進(jìn)一步論證，而爪甲團(tuán)囊菌目、刺盾炱目聚到一起的支持率高達(dá)84%。此系統(tǒng)發(fā)育樹中，柔膜菌目與糞殼菌綱的3個(gè)目聚到了一起，推測是由于柔膜菌目所屬的錘舌菌綱與糞殼菌綱關(guān)系較近，均屬于盤菌亞門[16-17]。這也從另外一個(gè)側(cè)面表明，囊菌門綱的劃分及之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系仍須進(jìn)一步研究。

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