大孔吸附樹脂分離純化白屈菜總生物堿的研究

昝立峰　李丹花　葛水蓮　葉嘉

摘要：采用紫外可見分光光度法測定白屈菜（Chelidonium majus）總生物堿的含量，比較了10種大孔樹脂對白屈菜總生物堿的吸附和解吸性能，從中篩選出適合分離純化白屈菜總生物堿的大孔吸附樹脂，并對其吸附和解吸條件進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，HPD600樹脂為純化白屈菜總生物堿的良好樹脂，確定最佳吸附流速2.0 BV/h，吸附液pH對吸附影響較小，解吸劑為70%～80%乙醇。經(jīng)HPD600樹脂精制得到的白屈菜總生物堿相對含量為39.8%，該結(jié)果可為白屈菜總生物堿的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：白屈菜（Chelidonium majus）；總生物堿；大孔吸附樹脂；純化

中圖分類號：S567.23+9；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-2082-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.041

Abstract：The absorption and desorption properties of ten kinds of macroporous resin were studied.Of the ten resins screened.The results showed that HPD600 was the best type to isolate alkaloids from the Chelidonium majus. The total content of alkaloids was measured by UV·spectrophotometric method.It is indicated that the optimum condition to purify total alkaloids by HPD600 was to control the flow velocity at 2 BV/h， pH value at 6.0～7.0 and with 70%～80% ethanol as washing solution. The total alkaloids produced by this process was brown powder，and the content was up to 39.8%，which laid a foundation for the development and utilization of total alkaloids from Chelidonium majus.

Key words：Chelidonium majus；total alkaloids；macroporous resin；purification

白屈菜（Chelidonium majus）為嬰粟科白屈菜屬植物，喜生于山谷的濕潤地帶，林緣水溝邊，主要分布于中國的東北、華北、西北地區(qū)，是北方山區(qū)常見的藥用植物。白屈菜全草均可入藥，具有清熱解毒、鎮(zhèn)痛、止咳、平喘、療瘡消腫等功能。白屈菜中含有多種活性成分，已從白屈菜中分離鑒定出29種生物堿，主要包括白屈菜堿、白屈菜紅堿、血根堿等。草身含生物堿0.97%～1.87%，而根含生物堿最高，為1.90%～4.14%[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)白屈菜生物堿具有顯著的鎮(zhèn)痛、祛痰止咳、抗炎抑菌、抗腫瘤和抗病毒等多種生物活性，因此越來越受到人們的重視[2]。

目前常用的酸水提取或乙醇提取并結(jié)合有機溶劑萃取法雖然可以去除大量雜質(zhì)，但白屈菜生物堿的分離、富集、純化仍然有一定的難度。大孔吸附樹脂則是一種比較理想的純化生物堿的手段，雜質(zhì)和目標(biāo)物因功能基團(tuán)和分子大小的差異，在大孔樹脂上表現(xiàn)出吸附性的強弱，從而達(dá)到分離效果[3，4]。選用合適的大孔吸附樹脂是純化的關(guān)鍵，本研究對國產(chǎn)主要大孔吸附樹脂純化白屈菜總生物堿進(jìn)行了篩選，從中篩選出較為理想的樹脂，并對樹脂分離純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為白屈菜總生物堿的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：白屈菜于2014年7月采集自河北邯鄲市武安長壽村，由邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院焦云紅副教授鑒定，采集后迅速殺青、陰干并粉碎過40目篩，低溫冷藏備用。

試劑：白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品（上海彩佑實業(yè)有限公司）；無水乙醇、鹽酸均為分析純；大孔吸附樹脂：HPD-600、HPD-722（滄州寶恩吸附材料科技有限公司），D-101、AB-8（安徽三星樹脂科技有限公司生產(chǎn)），LX-1、LX-11、LX-17、LX-60、LSA-21（西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司），DM-21（山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司）。

儀器：分析天平、超聲波清洗儀、UV6500型紫外可見分光光度計、精密酸度計、真空干燥箱、全溫振蕩培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 先用1～2 BV 95%乙醇浸泡各類型大孔吸附樹脂24 h，用蒸餾水沖洗至無醇味，然后分別用2 BV 4%～6% NaOH溶液和4%～6%鹽酸溶液浸泡2 h以上，蒸餾水洗至pH中性，即可使用。

1.2.2 白屈菜提取物的制備 稱取白屈菜粉末500 g，按質(zhì)量體積比1∶6加入60%乙醇溶劑，在55 ℃條件下提取3 h，提取3次，提取液離心后抽濾得過濾液，減壓濃縮得到白屈菜總生物堿浸膏，4 ℃冰箱保藏備用。使用前用蒸餾水溶解并過濾。

1.2.3 白屈菜總生物堿含量測定 最大吸收波長的確定：稱取干燥的白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品0.01 mg置于容量瓶中，用95%乙醇溶解配制成濃度為0.01 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，在200～600 nm范圍內(nèi)全程掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白屈菜紅堿在282 nm處有最高吸收峰，確定282 nm為測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別移取濃度為0.01 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL容量瓶中，95%乙醇定容之后，用紫外分光光度計在282 nm下測定吸光度（A），以所得A值對標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行線性回歸，求回歸方程為A=986.5X-0.009 3；R2=0.999 5。

總生物堿含量的測定：取適量樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作。定容后在282 nm 波長下測定吸光度A，根據(jù)回歸方程計算出總生物堿濃度，結(jié)合提取液體積測定出總生物堿的含量。

1.2.4 靜態(tài)吸附量和解吸率測定

1）靜態(tài)吸附量的測定。將預(yù)處理后的大孔樹脂各稱取5 g置于相對應(yīng)的已標(biāo)記好的250 mL錐形瓶中，每種樹脂平行3組，分別加入已知含量的白屈菜提取液50 mL，置搖床振蕩，搖床溫度設(shè)為25 ℃，時間設(shè)為3 h，吸附完成后，過濾，用紫外分光光度計測定濾液的吸光度，求得白屈菜總生物堿的含量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各類型樹脂的吸附量。取3次結(jié)果的平均值。

Q1=（C0-C1）×V1/m α=（C0-C1）/C0×100%

式中，Q1為大孔樹脂吸附量（mg/g），α為大孔樹脂吸附率（%），C0為白屈菜提取液起始濃度（mg/mL），C1為殘余濃度（mg/mL），V1為溶液體積（mL），m為樹脂質(zhì)量（g）。此計算方法吸附前后體積假定不變。

2）靜態(tài)解吸率的測定。將靜態(tài)吸附飽和的樹脂用蒸餾水沖洗干凈，分別加入80%乙醇75 mL于已標(biāo)記好的250 mL錐形瓶中，各種樹脂平行設(shè)置3組，放入搖床振蕩，振蕩溫度設(shè)為25 ℃，時間設(shè)為3 h，解吸完全后，抽濾，收集濾液，測定濾液的吸光度，求得總生物堿的含量，計算各樹脂的解吸率，取3次重復(fù)的平均值。

β=[C2V2/（C0-C1）V1]×100%。

式中，C2為解吸液濃度（mg/mL）；V2為解吸液體積（mL）；β為大孔樹脂解吸率（%）。

1.2.5 HPD600大孔吸附樹脂純化白屈菜總生物堿的工藝 稱取100 mL HPD600樹脂，經(jīng)預(yù)處理后，濕法裝入層析柱子中，使用前用純凈水沖洗至中性狀態(tài)。按照上述制備提取液方法制備一定量的白屈菜提取液，并測定提取液中生物堿的含量；以一定的吸附速率上大孔樹脂柱，待上柱完成后，檢測下柱子水中生物堿的損失量，然后用2 BV的純凈水洗滌。用3 BV的洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗脫流速調(diào)節(jié)在1.5 BV/h，收集洗脫液，減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，測定洗脫液中總生物堿的含量。考察樣品溶液pH、樣品溶液濃度、吸附速率及乙醇體積分?jǐn)?shù)、流速、解吸液用量對解吸的影響。

1）pH對白屈菜總生物堿吸附效果的影響。將一定濃度的白屈菜提取液50 mL分別用0.5 mol/L NaOH溶液、0.5 mol/L HCl溶液配成不同pH，按“1.2.3”的方法測定總生物堿的含量，計算吸附率，重復(fù)3次，取平均值。

2）流速對總生物堿吸附效果的影響。將一定濃度的白屈菜提取液分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 BV/h的流速上柱，收集不同倍數(shù)樹脂體積（BV）溶液，按“1.2.3”的方法測定總生物堿含量，考察不同流速下樹脂的吸附效果，重復(fù)3次，取平均值。

3）樣品濃度對總生物堿吸附效果的影響。將一定濃度的白屈菜提取液分別配制成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL，以2.0 BV/h的流速通過樹脂，收集不同倍數(shù)樹脂體積（BV），按“1.2.3”的方法計算總生物堿含量，考察不同濃度下的吸附效果，計算吸附率，重復(fù)處理3次，取平均值。

4）乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸效果的影響。樹脂吸附總生物堿達(dá)到飽和后，用去離子水洗滌至流出液呈澄清狀態(tài)。然后用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇以2 BV/h的流速沖洗樹脂柱進(jìn)行解吸，重復(fù)3次，測定總生物堿的含量，計算解吸率。

1.2.6 HPD600動態(tài)解吸曲線 白屈菜提取液通過HPD600樹脂柱吸附飽和后，用4倍量的去離子水洗滌樹脂，至流出液無顏色，再用70%乙醇溶液通過樹脂柱解吸，解吸液每0.5 BV為一流份，直至解吸完全。洗脫時流速越高，拖尾現(xiàn)象越明顯，所需要的洗脫劑越多，根據(jù)查閱資料，一般解吸流速為吸附流速的1/2，因此以1 BV/h為洗脫流速，繪制動態(tài)解吸曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的選擇

從表1可以看出，所選10種大孔吸附樹脂對白屈菜提取液中的生物堿均有一定的吸附量，但差異明顯，其中非極性樹脂LX-60、HPD600的吸附量達(dá)到38 mg/g以上，高于另外8種樹脂的吸附效果，而極性樹脂LX-17的吸附量僅為19.71 mg/g。LX-60的吸附量最高，為42.65 mg/g，但該樹脂的解吸率為59.66%，而HPD600的解吸率為91.32%，綜合樹脂吸附量與解吸率分析，采用大孔吸附樹脂HPD600分離純化白屈菜總生物堿更為合適。

2.2 HPD600大孔吸附樹脂純化白屈菜總生物堿的工藝

2.2.1 pH對總生物堿吸附效果的影響 由圖1可以看出，在pH為3.0～9.0，白屈菜總生物堿在HPD600樹脂的吸附率差異不明顯，均在88%左右，相對而言，在pH為6.0時，吸附率最高，達(dá)到89.36%。因此，在生產(chǎn)中可以選擇pH在6～7的中性狀態(tài)，同時可以節(jié)約調(diào)節(jié)酸堿度帶來的成本。

2.2.2 流速對總生物堿吸附效果的影響 由圖2可以看出，樣品溶液的流速越慢，吸附效果越好，幾種流速中，從1.0～2.0 BV/h的吸附率變化不顯著，吸附率均在85%以上，而當(dāng)吸附流速為2.5 BV/h時，白屈菜總生物堿的吸附率為83.2%，但當(dāng)流速為3.0 BV/h時，總生物堿尚未及時被吸附就隨著吸附液流出，吸附率降為75.8%。綜合考慮生產(chǎn)效率和成本核算，選擇2.0 BV/h流速比較合適。

2.2.3 濃度對總生物堿吸附效果的影響 由圖3可以看出，樣品濃度在0.2～0.8 mg/mL時，白屈菜總生物堿的吸附率變化不明顯，但隨樣品質(zhì)量濃度的增加，濃度達(dá)到1.0 mg/mL以上時，上樣過程中部分生物堿形成絮狀沉淀析出，導(dǎo)致吸附減少，容易堵塞樹脂，隨著樣品體積的增加，總生物堿的析出增加，回收率降低。但如果樣品液濃度太低，上樣需要較長時間，導(dǎo)致生產(chǎn)效率降低，綜合考慮，選擇樣品的上柱濃度為0.8 mg/mL左右最佳。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸能力的影響 試驗中選擇的解吸液為30%～90%乙醇溶液，由圖4可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，解吸率逐漸升高，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，總生物堿的解吸率最高為88.28%，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時，解吸率幾乎沒有變化，為88.17%，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時的解吸率略降低，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇其極性不同，70%～80%的乙醇與總生物堿的極性較為接近，同時考慮到節(jié)約成本，試驗確定70%乙醇為最佳解吸劑。

2.2.5 HPD600動態(tài)解吸曲線 圖5顯示，70%乙醇洗脫液通過樹脂柱1/2時總生物堿開始被洗脫下來，1.5 BV后迅速升高，乙醇通過3.0 BV后，解吸達(dá)到最高峰，當(dāng)通過4.0 BV解吸液時，樹脂上吸附的總生物堿基本上洗脫下來。從整個圖譜可以看出，該方法出峰快，且無明顯拖尾現(xiàn)象。合并解吸液減壓濃縮，真空干燥得到白屈菜總生物堿，總生物堿得率為3.12%，相對含量為39.8%。劉楠楠[5]曾用AB-8提取純化白屈菜總生物堿，結(jié)果得到提取的總生物堿得率為2.74%，總生物堿相對含量為35.54%。

3 結(jié)論

對10種大孔樹脂的篩選試驗結(jié)果表明，HPD600大孔吸附樹脂對白屈菜生物堿具有良好的吸附和解吸能力，適用于白屈菜生物堿的純化。上柱流速越快，總生物堿的泄露點出現(xiàn)得越早，綜合考慮生產(chǎn)效率和成本核算，采用2 BV/h的上柱流速，pH為6.0～7.0時上柱，此pH條件下的吸附效果最好，70%～80%乙醇的解吸率最高。動態(tài)解吸試驗證明，上述洗脫方法可行，出峰快，且無明顯拖尾現(xiàn)象。經(jīng)HPD600純化后的白屈菜生物堿，通過UV檢測總生物堿的含量，得率為3.12%，相對含量為39.8%，可見HPD600大孔吸附樹脂可以作為一種良好的白屈菜總生物堿純化樹脂使用。

參考文獻(xiàn)：

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[3] 劉俊紅，魏峻峰，王洪志，等.大孔吸附樹脂在延胡索生物堿提取分離中的應(yīng)用[J].中草藥，2002，33（1）：37-38.

[4] PANYE G F，SHULER M L. Application of adsorbent amberlite XAD-4 and XAD-7 in extraction and separation of indole alkaloid[J]. Biotechnology and Bioengineering，1988，31（6）：922.

[5] 劉楠楠.白屈菜總生物堿提取、安全性評價及體外抑菌作用研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.