黑尾近紅鲌精子活力研究

王貴英　李清　祝東梅　李佩　熊傳喜　劉文偉　陳見　孫艷紅

摘要：在水溫23 ℃的條件下，對黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）精子在不同濃度氯化鈉溶液、不同水體以及不同離體時(shí)間情況下的活力進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，①在0～1.2%的氯化鈉溶液中，氯化鈉濃度小于0.5%時(shí)，隨著濃度的增加，黑尾近紅鲌精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨之延長；在0.5%氯化鈉溶液中，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長（52.00±3.46 s），與其他組別差異顯著（P<0.05）；當(dāng)濃度大于0.9%時(shí)，精子未激活。②精子在蒸餾水中的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間（36.33±1.15 s）顯著（P<0.05）高于在自來水（32.00±1.00 s）和池塘水（27.67±1.52 s）中。③采用蒸餾水激活離體精子1～15 h，隨著時(shí)間的延長，存活精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間無顯著差異（P>0.05），而精子成活率顯著降低（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）；精子活力；激活劑

中圖分類號：S965.123 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-2062-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.036

Abstract： The spermatozoa motility of Ancherythroculter nigrocauda in different concentrations of NaCl solution， different water bodies and different strorage time in vitro were investigated under the temperature of 23 ℃.The results showed as follows： ①In 0～1.2% NaCl solution， the rapid movement time of the sperm of A. nigrocauda tended to longer with the increase of NaCl concentration when it was less than 0.5%； the life span of the sperm of A. nigrocauda （52.00±3.46 s） was the longest at 0.5% NaCl solution， which had significant difference （P<0.05） with compared to other groups； When the NaCl concentration was higher than 0.9%， the initiation of the sperm of A. nigrocauda was inhibited.②The rapid movement time of the sperm of A. Nigrocauda in distilled water （36.33±1.15 s） was significantly （P<0.05） higher than that of tap water （32.00±1.00 s） and the pond water （27.67±1.52 s）.③Using distilled water to activate the sperm of A. Nigrocauda in vitro 1～15 h， the rapid movement time of the survival sperms had no significant difference （P>0.05） with the extension of time， while the survival rate of sperm significantly reduced （P<0.05）.

Key words： Ancherythroculter nigrocauda； sperm motility； activator

魚類精子是一類分化程度很高的細(xì)胞，在精巢中不活動(dòng)，一旦與其生存的水環(huán)境接觸，精子便立即被激活而開始運(yùn)動(dòng)。激活精子并影響精子活力的因素很多，如滲透壓、無機(jī)離子、酸堿度、水溫。對魚類精子而言，滲透壓的影響至關(guān)重要[1]，精子的部分能量就是消耗在滲透壓的調(diào)節(jié)上。Morisawa等[2]用不同滲透壓的氯化鈉、氯化鉀和甘露醇溶液進(jìn)行精子激活試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一些淡水硬骨魚類，如鯽（Carassius auratus）、褐三齒雅羅魚（Tribolodon hakonensis）的精子在高滲透壓溶液中不活動(dòng)，呈抑制狀態(tài)，若加入1滴去離子水，精子立刻被激活而運(yùn)動(dòng)，而用低滲透壓溶液去稀釋精子，同樣能誘發(fā)精子從抑制到激活狀態(tài)。王祖昆等[3]研究發(fā)現(xiàn)精子處于滲透壓偏高的溶液（大于270 mmol/L）中時(shí)，精子基本不活動(dòng)，即高滲溶液抑制精子，低滲溶液激活精子。當(dāng)溶液滲透壓超過500 mmol/L時(shí)，精子的激活將受到影響；當(dāng)溶液滲透壓低于200 mmol/L時(shí)，精子的抑制與激活反應(yīng)將逐步消失，淡水中激活后的精子將一直運(yùn)動(dòng)至死。羅明坤等[4]發(fā)現(xiàn)薩羅羅非魚（Sarotherodon melanotheron）精子在2.5%～3.2%的鹽度范圍內(nèi)，薩羅羅非魚精子活力較強(qiáng)，其中以3.0%的鹽度時(shí)精子活力最高，激活率達(dá)90%。徐敏等[5]研究發(fā)現(xiàn)鹽度為4時(shí)，方正銀鯽[Carassius auratus gibelio（Bloch）]和大鱗鲃（Barbus capito）精子的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最長；鹽度為5時(shí)，松浦鏡鯉（Songpu mirror carp）精子的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間、快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最長；鹽度達(dá)到8以上時(shí)，3種魚的精子激活將受到抑制；鹽度大于10時(shí)，方正銀鯽和大鱗鲃精子死亡；鹽度大于11時(shí)，松浦鏡鯉精子死亡。精子活力是指精子群體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與壽命長短，是反映精子質(zhì)量的重要指標(biāo)。精子活力評價(jià)是研究精子生理特性、精子受精、精子保存的基礎(chǔ)。魚類精子在良種選育、雜交育種、種質(zhì)保護(hù)及種質(zhì)改良等方面得到了廣泛應(yīng)用。

黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda Yih et Wu）俗名高肩、黑尾鲌，是鲌亞科魚類中生長較快、味道鮮美的優(yōu)良品種，深受廣大養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的青睞。許多學(xué)者先后開展了黑尾近紅鲌肌肉成分、生物學(xué)、人工繁養(yǎng)技術(shù)等方面的研究，如譚德清等[6]評價(jià)了黑尾近紅鲌肌肉營養(yǎng)成分；薛正楷等[7-9]研究了黑尾近紅鲌個(gè)體繁殖力、自然條件下的年齡與生長、比例性狀、體長與體重的關(guān)系；李清[10]研究了黑尾近紅鲌耗氧率與窒息點(diǎn)；王貴英等[11]、曹義虎等[12]研究了人工養(yǎng)殖條件下的黑尾近紅鲌生長情況；丁立云等[13]初步研究了黑尾近紅鲌幼魚對蛋白質(zhì)營養(yǎng)需求；李偉東等[14]研究了黑尾近紅鲌飼料的適宜脂肪水平；白曉慧等[15]研究了不同年齡的黑尾近紅鲌消化酶活性。目前，關(guān)于黑尾近紅鲌精子活力研究尚未見報(bào)道，為加速其育種進(jìn)程和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，精子生物學(xué)特性研究顯得尤為重要，本試驗(yàn)研究不同濃度氯化鈉溶液以及不同水體對黑尾近紅鲌精子活力的影響，旨在為其科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

黑尾近紅鲌取自武漢先鋒水產(chǎn)科技有限公司繁養(yǎng)基地，個(gè)體重0.6 kg左右，年齡為2冬齡，體質(zhì)健壯，體表光滑無傷。

1.2 激活劑的配制和采集

激活劑采用0～1.2%的氯化鈉溶液共13個(gè)濃度梯度，曝氣自來水取自于繁養(yǎng)基地，池塘水來自于繁養(yǎng)基地的小型水庫。

1.3 精子的采集與保存

采用DOM、LRH-A2、HCG等激素配伍對黑尾近紅鲌進(jìn)行催情后，將雄性黑尾近紅鲌捕起，用干毛巾擦干體表和泄殖孔，輕壓腹部取其精液，分別收集在潔凈干燥的試管中。要求精液呈乳白色，無血、無尿液、無糞便污染；精子采集以后，應(yīng)避免紫外線照射，盛有精液的試管置于放有冰塊的保溫瓶內(nèi)備用。同時(shí)，試驗(yàn)樣品保持在試驗(yàn)過程中不被風(fēng)干。

1.4 精子活力觀察

根據(jù)精子群體在激活液中的運(yùn)動(dòng)狀況，不同的研究者將其分為不同的階段。通過對精子運(yùn)動(dòng)狀況的觀察來直接反映其活力情況，精子活力等級劃分參照吳景貴[16]的方法，將精子運(yùn)動(dòng)分為快速運(yùn)動(dòng)、中速運(yùn)動(dòng)、慢速運(yùn)動(dòng)、死亡，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間是從精液與試驗(yàn)溶液混合后70%的精子細(xì)胞轉(zhuǎn)化為中速運(yùn)動(dòng)的時(shí)間，視野中有95%的精子停止運(yùn)動(dòng)的時(shí)間為其壽命時(shí)間。

用吸管吸1滴試驗(yàn)溶液于載玻片上，然后用解剖針挑取少許新鮮精液置入載玻片的液滴中，立即在10×40倍顯微鏡下觀察精子被激活后的運(yùn)動(dòng)狀況，并統(tǒng)計(jì)所經(jīng)歷的時(shí)間，每尾魚鮮精連續(xù)觀察3次，取其平均值[17]。解剖針每次蘸取后要用擦拭紙擦干凈，以免對下組試驗(yàn)造成污染。精子活力觀察分為3個(gè)內(nèi)容：①不同濃度氯化鈉溶液對黑尾近紅鲌精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響，采用楊彩根等[18]、羅相忠等[19]的方法配制0～1.2% 13個(gè)濃度梯度的氯化鈉溶液，對精子進(jìn)行激活；②池塘水、自來水、蒸餾水對黑尾近紅鲌精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響；③采用蒸餾水激活，觀察離體精子1～15 h的活力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Statistica 6.0軟件進(jìn)行分析，組間采用Duncans多重比較，進(jìn)行顯著性水平分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度氯化鈉溶液對黑尾近紅鲌精子活力的影響

不同濃度氯化鈉溶液中，黑尾近紅鲌精子活力不同。由表1可見，在水溫23 ℃時(shí)，精子適宜的氯化鈉濃度為0.5%～0.6%。當(dāng)氯化鈉濃度為0.5%時(shí)，精子的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間達(dá)到最大值，為（52.00±3.46） s；氯化鈉濃度大于0.5%時(shí)，精子的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨濃度的上升而呈下降趨勢；氯化鈉濃度大于0.9%時(shí)，精子不能激活。通過對各組進(jìn)行單因素的顯著性檢驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)0.5%組與其他組均存在顯著性差異（P<0.05）。

2.2 池塘水、自來水、蒸餾水對黑尾近紅鲌精子活力的影響

由表2可見，水溫23 ℃時(shí)，黑尾近紅鲌精子在不同水體中的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間不同，在池塘水、自來水和蒸餾水中的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別是（27.67±1.52） s、（32.00±1.00） s、（36.33±1.15） s；黑尾近紅鲌精子在池塘水、自來水和蒸餾水中的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間存在顯著性差異（P<0.05）。黑尾近紅鲌精子在蒸餾水中激活效果最好。

2.3 不同離體時(shí)間對黑尾近紅鲌精子活力的影響

由表3可見，采用蒸餾水激活，參照楊廣等[20]的方法對不同離體時(shí)間的黑尾近紅鲌精子進(jìn)行觀察，黑尾近紅鲌精子離體15 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，存活精子的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間（28.67～31.67 s）無顯著變化（P>0.05），而精子成活率（15.67%～95.67%）顯著降低（P<0.05）。

3 小結(jié)與討論

觀察比較黑尾近紅鲌精子在池塘水、自來水、蒸餾水中的活力，以在蒸餾水中的運(yùn)動(dòng)效果最佳，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間為（36.33±1.15） s，這可能與不同水體的離子濃度、pH有關(guān)，或與不同水體的復(fù)雜成分引起。在實(shí)際生產(chǎn)中，精卵受精的稀釋液建議采用蒸餾水。

黑尾近紅鲌精子在不同濃度氯化鈉溶液中的活力不同，在0～0.5%的范圍內(nèi)，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨濃度的增加而延長，以0.5%的濃度為最佳。氯化鈉濃度大于0.5%時(shí)，隨著濃度的增加，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間逐漸縮短；濃度大于0.9%時(shí)，黑尾近紅鲌精子不運(yùn)動(dòng)。本研究結(jié)果與楊彩根等[18]對黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）精子、魏開金等[21]對鰣魚（Macrura reevesi）精子、周定剛等[22]對黃鱔（Monopterus albus）精子、徐敏等[5]對松浦鏡鯉精子等研究結(jié)果是一致的；但與羅相忠等[19]對大口鲇（Silurus meridionlis）精子、羅明坤等[4]對薩羅羅非魚精子、陳春娜等[23]對達(dá)氏鱘精子等研究結(jié)果不同。造成這些差異的原因，主要與不同魚類精液的生理特性不同有關(guān)。

采用蒸餾水作為激活劑觀察不同離體時(shí)間的精子活力，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長，存活的精子數(shù)越來越少；但只要精子是存活的，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間在各組之間無顯著性差異（P>0.05）。這可能與精子在精液中的分布情況有關(guān)，精子從精巢排出后，精子的生存環(huán)境發(fā)生了改變，處于外圍的精子易受外界條件的變化而影響存活；也可能與激活劑自身的激活機(jī)制有關(guān)，以至于用同一種激活劑在不同的時(shí)間條件下激活時(shí)會(huì)造成運(yùn)動(dòng)時(shí)間的一致性。

精子在精液和精漿中是沒有活性的，只有當(dāng)外界條件給予激活時(shí)才表現(xiàn)出一定的活性。精子的運(yùn)動(dòng)主要靠尾部鞭毛的擺動(dòng)來進(jìn)行，能量由頂體來提供。精子鞭毛大多為9+2結(jié)構(gòu)，其外周的每對雙聯(lián)管中的亞管A含有動(dòng)力蛋白，動(dòng)力蛋白臂具有ATP酶活性，起著與橫紋肌球蛋白橫橋類似的機(jī)能作用。外界通過對cAMp-ATP-Mg2+系統(tǒng)的影響來實(shí)現(xiàn)對精子活力的控制。滲透壓是影響精子活力的主要因素。Morisawa等[2]發(fā)現(xiàn)淡水硬骨魚的精子可以被低于精漿滲透壓的溶液激活，而海水硬骨魚的精子可以被高于滲透壓的溶液激活。鹽類對精子活力具有調(diào)節(jié)作用，但是不同的鹽類其調(diào)節(jié)的具體機(jī)制不同。有的無機(jī)鹽表現(xiàn)出激活，有的卻表現(xiàn)出抑制。本研究中NaCl（特別是Na+）對黑尾近紅鲌精子在一定濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出了明顯的激活傾向。NaCl在0～0.5%的濃度范圍內(nèi)，表現(xiàn)為逐漸激活；而濃度大于0.5%時(shí)，表現(xiàn)出抑制，在0.9%以上時(shí)黑尾近紅鲌精子就完全不動(dòng)了。因此，黑尾近紅鲌人工受精時(shí)，可選擇濃度為0.5%的NaCl溶液激活。

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