金銀花葉提取物對(duì)棘胸蛙爛皮病治療效果的探討

王瑞君　熊筱娟　李志元

摘要：研究了金銀花（Lonicera japonica）葉不同溶劑提取物對(duì)棘胸蛙（Rana spinosa）爛皮病治療效果的影響。首先制備金銀花葉的水提物與醇提物，分別用終濃度為16 mg/mL的水提物和醇提物浸浴患病蝌蚪，比較蝌蚪的存活量和平均體重。結(jié)果表明，金銀花葉醇提物治療組的蝌蚪存活數(shù)量遠(yuǎn)高于金銀花葉水提物治療組。說(shuō)明金銀花葉的醇提物對(duì)患病蝌蚪有較好的治療效果。

關(guān)鍵詞：金銀花（Lonicera japonica）葉；醇提物；水提物；棘胸蛙（Rana spinosa）；爛皮病

中圖分類號(hào)：R284；S947.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）08-2055-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.034

Abstract： In this study the treatment effect of different extracts from Leaves of Lonicera japonica on skin ulceration disease of Rana spinosa were compared. The water extracts and ethanol extracts from Leaves of Lonicera japonica were used on sickened tadpoles with the final concentration of 16 mg/mL.The results showed that the survival number of tadpoles in ethanol extracts group was significantly higher than the water extracts group.It indicated that the ethanol extracts from Lonicera japonica leaves has a good treatment effect on the sickened tadpoles.

Key words： Lonicera japonica leaves；ethanol extract；water extract；Rana spinosa；skin ulceration disease

棘胸蛙（Rana spinosa）是中國(guó)主要的養(yǎng)殖蛙之一，俗稱石蛙、石雞等。在中國(guó)，野生棘胸蛙主要分布在江西、福建、云南、江蘇、浙江、湖南等地。棘胸蛙因肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富而備受百姓青睞。資料顯示[1]，棘胸蛙肉質(zhì)含有人體必需的8種氨基酸，具有重要的食用藥用價(jià)值，是重要的保健滋補(bǔ)品。

棘胸蛙主要棲息在水質(zhì)清澈的流動(dòng)水體中。但是，在棘胸蛙養(yǎng)殖中，由于養(yǎng)殖密度大、水體流動(dòng)性差、殘留餌料易腐敗等原因而易患病。蝌蚪期與成蛙所患疾病主要有紅腿病[2]、爛皮病[3]、輪蟲(chóng)病[4]等，或兩種以上疾病同時(shí)發(fā)生。如以抗生素治療蛙病，易造成水體、土壤等周圍環(huán)境的二次污染，易導(dǎo)致耐藥病原體的傳播，也易使蛙類食品中出現(xiàn)抗生素殘留而不符合食品要求。而中草藥具有安全、無(wú)污染、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于蛙類疾病的治療中。本試驗(yàn)旨在探討中草藥金銀花葉提取物對(duì)棘胸蛙爛皮病的治療作用，以促進(jìn)棘胸蛙人工養(yǎng)殖的健康發(fā)展，提供安全的棘胸蛙食品。

金銀花（Lonicera japonica）為忍冬科忍冬屬植物，具有抗菌、消炎、解毒、清熱、保肝等功效，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品等方面。但一般利用金銀花的花蕾，金銀花的葉一般被看做副產(chǎn)物?，F(xiàn)有研究資料表明[5]，金銀花葉的化學(xué)成分與花類似，只是同一成分在不同部位的含量可能有所不同。研究發(fā)現(xiàn)[6]，相同中藥不同溶劑提取物的抑菌活性不同。本試驗(yàn)探討了金銀花葉不同溶劑提取物對(duì)患爛皮病棘胸蛙蝌蚪治療效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 石蛙蝌蚪 三高綠箭石蛙養(yǎng)殖基地提供。

1.1.2 金銀花葉 購(gòu)于江西省宜春金銀花培養(yǎng)基地。

1.1.3 其他主要試劑及儀器 乙醇（國(guó)藥集團(tuán)AR）、微型植物粉碎機(jī)（FW177型，天津泰斯特儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE3000A型，上海亞榮生化儀器廠）、蒸餾器（YN-ZD-20型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 金銀花葉提取物的制備

1）金銀花葉水提物的制備。精確稱取1.6 kg金銀花葉，粉碎，蒸餾水浸泡，密封，室溫放置4 h。水浴加熱回流1 h。濾渣加水做第二次加熱回流30 min。重復(fù)2次。3次濾液混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥濃度為0.8 g/mL。

2）金銀花葉醇提物的制備。精確稱取金銀花葉1.6 kg，粉碎，75%乙醇浸泡，密封后室溫放置4 h。75%乙醇回流1 h。濾渣中加75%乙醇，回流30 min。重復(fù)2次。3次濾液混合后濃縮至生藥濃度為0.8 g/mL。

1.2.2 蝌蚪分組與處理 患病蝌蚪的主要癥狀為白鰭、皮膚有潰爛，為典型的爛皮病癥狀。隨機(jī)取正常和患病蝌蚪分為4組，每組99尾。

1）正常對(duì)照組：隨機(jī)挑取健康無(wú)病的蝌蚪99尾，稱重，計(jì)算每尾平均體重。正常喂養(yǎng)24 h后進(jìn)入正式試驗(yàn)。每天上午7：00～8：00時(shí)間段內(nèi)，蛙池內(nèi)水停止流動(dòng)，水總量為100 L。8：00后，水體恢復(fù)為通常流速，蝌蚪正常喂養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行3 d。第四天改為正常換水和喂養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行7 d。7 d后，即第11天上午稱量蝌蚪體重，計(jì)算每尾蝌蚪平均體重。

2）患病對(duì)照組：隨機(jī)挑取患病蝌蚪99尾，稱重，計(jì)算每尾平均體重。分組完畢，同樣是正常喂養(yǎng)24 h后，進(jìn)入正式試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程同正常對(duì)照組。

3）治療1組（金銀花葉水提物治療組）：隨機(jī)挑取患病蝌蚪99尾，稱重，計(jì)算每尾平均體重。分組完畢，正常喂養(yǎng)24 h后進(jìn)入正式試驗(yàn)。每天上午7：00～8：00時(shí)間段內(nèi)，蛙池內(nèi)水停止流動(dòng)，加入金銀花葉水提物治療，溶液終體積為100 L，生藥終濃度為16 mg/mL。8：00后，恢復(fù)常規(guī)換水和喂養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行3 d。第四天停止用藥，按常規(guī)換水和喂料，連續(xù)進(jìn)行7 d。第11天上午稱量蝌蚪體重，計(jì)算每尾蝌蚪平均體重。

4）治療2組（金銀花葉醇提物治療組）：隨機(jī)挑取患病蝌蚪99尾，稱重，計(jì)算每尾平均體重。分組完畢，正常喂養(yǎng)24 h后進(jìn)入正式試驗(yàn)。每天上午7：00～8：00時(shí)間段內(nèi)，蛙池內(nèi)水停止流動(dòng)，加入金銀花葉醇提物治療，溶液終體積為100 L，生藥終濃度為16 mg/mL。8：00后，恢復(fù)為常規(guī)換水和喂養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行3 d。第四天改為常規(guī)換水和喂料，連續(xù)進(jìn)行7 d。第11天上午稱量蝌蚪體重，計(jì)算每尾蝌蚪平均體重。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Spss17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

由表1可見(jiàn)，連續(xù)用藥3 d后，治療1組蝌蚪存活數(shù)量低于治療2組與正常對(duì)照組（P﹤0.05），但高于患病對(duì)照組。停止用藥7 d后（第11天）的數(shù)據(jù)表明，治療1組蝌蚪死亡數(shù)高于治療2組與正常對(duì)照組（P﹤0.01），但低于患病對(duì)照組（P﹤0.05）。治療2組雖然有蝌蚪死亡，但與正常對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。

為防止捕撈等人為外力干擾影響蝌蚪的生長(zhǎng)和治療，在治療3 d后并沒(méi)有對(duì)蝌蚪稱重，只是在試驗(yàn)的開(kāi)始和結(jié)束后稱量蝌蚪的體重。由圖1可見(jiàn)，治療2組蝌蚪平均體重的增加值高于治療1組，與正常對(duì)照組相比差異不顯著。結(jié)果表明，金銀花葉醇提物的治療效果顯著優(yōu)于金銀花葉水提物。

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，金銀花葉對(duì)棘胸蛙蝌蚪病原體具有抑制作用。一些相關(guān)文獻(xiàn)的體外試驗(yàn)也得出了類似的結(jié)論。李世傳等[7]報(bào)道金銀花葉對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有抑制作用。趙彥杰[8]的研究結(jié)果顯示，金銀花葉提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、青霉、黃曲霉、黑曲霉和釀酒酵母等細(xì)菌和真菌均有一定的抑制作用。金銀花葉對(duì)病原體具有抑制作用，可能與其含有與花蕾相似的化學(xué)成分有關(guān)[5]。有關(guān)金銀花葉抑菌作用的研究主要集中于體外抑菌試驗(yàn)，有關(guān)動(dòng)物體內(nèi)的試驗(yàn)研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，金銀花葉醇提物的治療效果優(yōu)于水提物，與相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致。劉麗等[6]報(bào)道南五味子的乙醇提取物對(duì)所研究的8種致病菌的抑制作用最強(qiáng)；楊衛(wèi)東等[9]在研究不同溶劑對(duì)竹葉提取物抑菌作用的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯的提取物抑菌效果最好，丙酮次之，水提取物的抑菌效果不明顯。一般認(rèn)為金銀花植物中抗菌成分主要為綠原酸、黃酮等[10]。金銀花葉的醇提物對(duì)患爛皮病棘胸蛙蝌蚪有較好的治療效果，其原因可能是綠原酸、黃酮類物質(zhì)更易被乙醇等有機(jī)溶劑提取出來(lái)。有關(guān)棘胸蛙的病原體研究較少。在蛙類的紅腿病、爛皮病等疾病中常見(jiàn)的病原體有變形桿菌[11]、嗜水氣單胞菌[12]等。本研究中棘胸蛙蝌蚪具有白鰭、皮膚潰爛等爛皮病的典型癥狀，但具體由何種病原微生物引起相關(guān)癥狀還有待進(jìn)一步研究。

金銀花葉一年四季皆有，采集方便，產(chǎn)量遠(yuǎn)高于花蕾。本試驗(yàn)結(jié)果為擴(kuò)大金銀花葉的開(kāi)發(fā)利用提供了有益的借鑒。用金銀花葉等中草藥治療棘胸蛙疾病，減少了抗生素的使用，保證了食品的安全。

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