心包積液—肝壞死綜合征高免卵黃抗體的研制

李新正　黃安群　陳理盾　姬向波　肖曙光　靳雙星　黃炎坤

摘要：采取心包積液-肝壞死綜合征病雞的肝臟勻漿凍融，接種SPF雞胚，制備尿囊液滅活水苗，用兩種免疫程序?qū)Ξa(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)其卵黃抗體水平，制備高免卵黃抗體。經(jīng)中和試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示高免卵黃抗體對(duì)該病的預(yù)防和治療效果明顯。

關(guān)鍵詞：心包積液-肝壞死綜合征；組織滅活水苗；卵黃抗體；回歸試驗(yàn)；中和試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S855.3；S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）08-2053-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.033

Abstract： In this study， the liver homogenate from the sick chicken with pericardial effusion-hepatic necrosis syndrome was inoculated to SPF chicken embryo to prepare allantoic fluid inactivated vaccine after three times freezing and thawing. Two procedures were employed to immune the hens. Then， agar gel precipitation（AGP） was used to test the antibody level in yolk and prepared the yolk antibody. The neutralization test and clinical test identified that yolk antibody showed an obvious effect on preventing and curing for the disease.

Key words： pericardial effusion-hepatic necrosis syndrome. inactivated vaccine； yolk antibody； animal test； neutralization test

心包積液-肝壞死綜合征是由I群禽腺病毒引起[1]，近階段該病在河南、山東、河北、安徽、山西等省大面積流行，死亡率在10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%，且該病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，已成為危害蛋雞、肉雞生產(chǎn)的主要傳染病[2-6]。該病發(fā)病急、病程短，且無(wú)特效治療藥物，國(guó)內(nèi)無(wú)特異性疫苗。為此，研制抗心包積液-肝壞死綜合征卵黃抗體對(duì)發(fā)病雞群進(jìn)行治療成為主要控制途徑。對(duì)研制的心包積液-肝壞死綜合征卵黃抗體的安全性、效價(jià)及治療效果進(jìn)行了研究，旨在為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物：150日齡海蘭褐蛋雞300只（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院試驗(yàn)雞場(chǎng)提供）；SPF種蛋和SPF30日齡雛雞由中外合資山東濟(jì)南帕斯家禽有限公司提供；雞心包積液-肝壞死綜合征滅活苗和陽(yáng)性血清，由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物保健實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 方法

1.2.1 雞心包積液-肝壞死綜合征滅活水苗制備

取典型病例的肝臟組織，用生理鹽水以1∶10（m/V）制成組織勻漿液，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，取0.1 mL濾液尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，在37.8 ℃孵化箱內(nèi)繼續(xù)孵化，15日齡收取尿囊液，用1%甲醛滅活48 h，制成滅活水苗。

1.2.2 陽(yáng)性血清的制備 取1.2.1制備的滅活水苗注射30日齡SPF雛雞，每只0.5 mL，頸部皮下注射，間隔10 d后再次免疫注射1 mL/只，2周后采血分離血清。

1.2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取接種過(guò)心包積液-肝壞死綜合征病料的SPF雞胚尿囊液，接種10只30日齡SPF雛雞，頸部皮下注射0.2 mL/只，對(duì)照組10只注射生理鹽水0.2 mL/只，分別飼養(yǎng)在負(fù)壓隔離籠內(nèi)，觀察一周。

1.2.4 高免試驗(yàn) 試驗(yàn)分為3組，每組100只150日齡產(chǎn)蛋母雞，分別為試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和對(duì)照組，在同一飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)下飼養(yǎng)。試驗(yàn)前用雞沙門(mén)氏支原體全血平板凝集試驗(yàn)淘汰陽(yáng)性雞。試驗(yàn)1組為第一天注射滅活水苗1 mL/只，首免7 d后再注射2 mL/只；試驗(yàn)2組第一天注射生理鹽水1 mL/只，首免7 d后再注射滅活水苗1 mL/只。對(duì)照組注射等量生理鹽水。二免后5 、10、15、20 d，每組選5只雞進(jìn)行翅靜脈采血，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定其血清中抗體效價(jià)。

1.2.5 中和試驗(yàn) 選取30日齡SPF雛雞30只，分為3組，每組10只，分別為試驗(yàn)I組、試驗(yàn)II組和對(duì)照組。試驗(yàn)I組注射含心包積液-肝壞死綜合征病毒的尿囊液和心包積液-肝壞死綜合征抗體1∶1（V/V）混合物（混合物作用30 min后注射），頸部皮下注射0.4 mL/只；試驗(yàn)II組頸部皮下注射含心包積液-肝壞死綜合征病毒的尿囊液0.2 mL/只；對(duì)照組頸部皮下注射生理鹽水0.2 mL/只，分別飼養(yǎng)在負(fù)壓隔離籠內(nèi)，觀察試驗(yàn)雞精神狀態(tài)、采食、飲水、糞便等變化以及發(fā)病死亡情況。

1.2.6 高免卵黃抗體的制備 從高免試驗(yàn)的雞群1組和2組所產(chǎn)雞蛋中檢測(cè)抗體，收集抗體效價(jià)達(dá)到5.00 lg2的雞蛋作為高免蛋，儲(chǔ)存于0～4 ℃冷藏柜保存，備用[7]。高免卵黃抗體制備流程：用清水清洗高免蛋，用0.05%新潔爾滅浸泡15 min，清水沖洗晾干，卵黃與生理鹽水以1∶4（V/V）的比例混合，用組織搗碎機(jī)攪拌均勻，雙層紗布過(guò)濾，抑菌處理：勻漿液加萬(wàn)分之一硫柳汞，充分混勻，分裝，密封保存于-20 ℃冰箱。

1.2.7 成品檢驗(yàn) 無(wú)菌檢驗(yàn)：取成品0.2 mL，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，分別進(jìn)行厭氧和需氧培養(yǎng)，37.8 ℃增殖培養(yǎng)3 d觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.2.8 臨床應(yīng)用試驗(yàn) 河南中牟某養(yǎng)雞場(chǎng)飼養(yǎng)海蘭褐商品代母雞1萬(wàn)只（35日齡），發(fā)病4 d，每天死亡100多只，經(jīng)臨床和剖檢診斷為心包積液-肝壞死綜合征，用抗心包積液-肝壞死綜合征卵黃抗體注射，胸部肌肉注射1 mL/只。

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

試驗(yàn)組攻毒48 h后出現(xiàn)3只雞精神差，羽毛松亂，雞冠發(fā)白，皮膚發(fā)黃，拉黃色稀便，相繼發(fā)病，發(fā)病率90%，一周內(nèi)死亡6只，死亡率達(dá)60%。剖檢心包內(nèi)有大量的黃色滲出液；肺部淤血；肝臟腫大，邊緣鈍圓，色澤土黃，質(zhì)地變脆，在肝臟上有出血和淡黃色壞死點(diǎn)；膽囊充盈，膽汁色淡，稀薄如水；脾臟腫大，有壞死點(diǎn)；腎臟腫大，發(fā)黃；腺胃出血。而對(duì)照組無(wú)一發(fā)病，處死剖檢其內(nèi)臟無(wú)異常。

2.2 高免卵黃抗體效價(jià)

該組織苗吸收快，注射后5 d即可產(chǎn)生抗體，試驗(yàn)1組二免后5 d抗體水平平均為3.20 lg2，最高可達(dá)4.00 lg2；10 d抗體水平平均為4.80 lg2，最高可達(dá) 6.00 lg2；15d抗體水平平均為5.40 lg2，最高可達(dá)6.00 lg2（表1），試驗(yàn)1組抗體水平明顯高于試驗(yàn)2組。表明該卵黃抗體免疫2次效果較好，免疫后5 d可以有效保護(hù)雞群不發(fā)病。經(jīng)免疫后15 d可用其制備高免抗體。

2.3 中和試驗(yàn)結(jié)果

用心包積液-肝壞死綜合征病毒尿囊液和心包積液-肝壞死綜合征高免卵黃抗體中和30 min后注射SPF雞，觀察7 d，10只雞均未發(fā)病，剖檢其內(nèi)臟器官無(wú)異常。而用含心包積液-肝壞死綜合征病毒尿囊液接種的雞出現(xiàn)發(fā)病和死亡，剖檢出現(xiàn)典型心包積液-肝壞死綜合征病理變化，對(duì)照組無(wú)任何癥狀和病理剖檢變化。對(duì)發(fā)病雞群用心包積液-肝壞死綜合征卵黃抗體注射3 d后，雞群停止發(fā)病和死亡，恢復(fù)正常。

2.4 無(wú)菌檢驗(yàn)

生產(chǎn)出的高免卵黃抗體成品經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)均未發(fā)現(xiàn)厭氧和需氧細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.5 臨床應(yīng)用

經(jīng)走訪中牟養(yǎng)殖戶，對(duì)發(fā)病雞群注射心包積液-肝壞死綜合征卵黃抗體1 mL/只，3 d后雞群停止發(fā)病和死亡，恢復(fù)正常。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果可以看出雞心包積液-肝壞死綜合征病毒可在9日齡雞胚尿囊腔內(nèi)增殖和傳代，可用于疫苗生產(chǎn)中病毒擴(kuò)增。該尿囊液滅活水苗吸收快，注射5 d后可產(chǎn)生抗體，比用油苗產(chǎn)生抗體效果快，可用于緊急免疫接種，接種15 d后可用于生產(chǎn)高免卵黃抗體，且抗體維持時(shí)間長(zhǎng)，這與臨床上用患該病的肝臟組織自制自家滅活水苗的治療效果相一致。通過(guò)中和試驗(yàn)，說(shuō)明抗心包積液-肝壞死綜合征高免卵黃液具有中和抗原作用。雞心包積液-肝壞死綜合征高免卵黃抗體目前在國(guó)內(nèi)尚屬空白，在國(guó)內(nèi)無(wú)疫苗防控情況下，使用高免卵黃進(jìn)行預(yù)防和治療是一種較好的防控方法。通過(guò)臨床應(yīng)用取得滿意的效果，對(duì)于減少該病對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成的損失起到了重要的作用。高免試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)1組和2組的免疫程序?qū)ρ蹇贵w水平前期有一定影響，2周后抗體水平均達(dá)到25～26。1組產(chǎn)生免疫水平較高，而2組抗體水平偏低，建議制作心包積液-肝壞死綜合征高免卵黃抗體至少免疫2次，且間隔1月重復(fù)免疫1次。從試驗(yàn)1組試驗(yàn)結(jié)果可看出，注射尿囊液滅活水苗產(chǎn)生免疫快，5 d即可產(chǎn)生抗體，可用于緊急免疫接種和預(yù)防治療。心包積液-肝壞死綜合征是I群禽腺病毒引起的，I群禽腺病毒有12個(gè)血清型[8-10]，對(duì)該病毒的分型有待進(jìn)一步研究。

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