產(chǎn)2，4—二乙?；g苯三酚的微生物研究進展

唐茂　羅雪松

摘要：在土壤環(huán)境中，大多數(shù)2，4-二乙?；g苯三酚（2，4-DAPG）是由熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）產(chǎn)生的。它在生物防治中具有重要作用。對近年來2，4-DAPG的生物合成及調(diào)控機理，2，4-DAPG在誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）的機制，2，4-DAPG的生物反應(yīng)模式、生態(tài)效應(yīng)，熒光假單胞菌農(nóng)田生物防治應(yīng)用實例等相關(guān)研究進行了綜述。

關(guān)鍵詞：熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）；2，4-二乙?；g苯三酚（2，4-DAPG）；植物病害；生物防治

中圖分類號：Q939.96 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）08-1905-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.001

Abstract： In most cases， 2， 4-diacetylphloroglucinol （2，4-DAPG） were secondary metabolites produced by Pseudomonas fluorescens in soil. It was shown that this compound played an important role in biological control for the soil transmissible plant disease. In this paper， the authors summarized the recent discoveries in the research works that focused the biosynthesis of 2，4-DAPG， the mechanisms for the regulation of 2，4-DAPG synthesis， the role of 2，4-DAPG in inducing plant systemic resistance， the biological effect of 2，4-DAPG on pathogens， the ecology of 2，4-DAPG producing bacteria， and the field studies on biological control with 2，4-DAPG producing pseudomonads.

Key words： Pseudomonas fluorescens；2，4-diacetylphloroglucinol（2，4-DAPG）；plant disease；biological control

自然環(huán)境中2，4-二乙?；g苯三酚（2，4-DAPG）主要來自熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的次級代謝產(chǎn)物。它不僅能對抗植物病原菌，還能促進植物根系分泌氨基酸，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性反應(yīng)。而熒光假單胞菌是植物根際普遍存在的一種微生物類群，具有分布廣、數(shù)量多、繁殖快、競爭定殖力強的特點。因此，有效利用產(chǎn)2，4-DAPG的熒光假單胞菌有望成為極具應(yīng)用前景的植物病害生物防治手段。

1 2，4-DAPG的生物合成及調(diào)控機制

合成2，4-DAPG的基因簇由8個phl操縱子編碼。進化生物學(xué)研究表明，熒光假單胞菌2，4-DAPG合成基因簇屬于直系遺傳，但是很多假單胞菌在進化的過程中失去了產(chǎn)生2，4-DAPG的能力。盡管大多數(shù)phl基因簇總體上還是保持了完整性，然而其在直系遺傳過程中至少發(fā)生過3次基因水平轉(zhuǎn)移或重組事件[1]。

在參與合成2，4-DAPG的8個phl操縱子中，只有1個操縱子編碼合成酶系統(tǒng)（phlACBD）。其中PhlD是合成2，4-DAPG前體（PG、MAPG）的關(guān)鍵基因。phlACBD的下游基因phlE編碼輸出蛋白，其上游基因phlF、phlG和phlH編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，這些轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合啟動子區(qū)域抑制操縱子表達[2]。Tian等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，EmhABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對熒光假單胞菌2P24的2，4-DAPG的產(chǎn)生也具有一定作用。

目前國際上對來自龍爪稷根際的熒光假單胞菌Pf-5、2P24、CHAO的2，4-DAPG生物合成調(diào)控機制研究已較為深入。phlACBD在熒光假單胞菌Pf-5中大量表達，其產(chǎn)量通常是野生型菌株的2倍。2，4-DAPG的合成受植物分泌物等宿主因素的影響，其中RpoDσ因子對假單胞菌CHA0菌株合成2，4-DAPG起關(guān)鍵作用[4]。對熒光假單胞菌2P24菌株研究表明，gidA基因（PM701）或者trmE基因 （PM702）的缺失會導(dǎo)致菌株合成2，4-DAPG和其前體物質(zhì)（PG、MAPG）的能力大幅下降。這些基因突變雖然對phlA基因的轉(zhuǎn)錄沒有影響，但能降低phlA和phlD基因的蛋白表達水平。gidA和trmE突變體都不能合成間苯三酚（PG）但可以將PG轉(zhuǎn)化成MAPG，再轉(zhuǎn)化成2，4-DAPG。PhlD的超表達則可以使突變體恢復(fù)PG和2，4-DAPG的合成能力。這表明，GidA和TrmE極可能在轉(zhuǎn)錄后水平正調(diào)控2，4-DAPG的生物合成[5]。另一研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌株2P24的Gac/Rsm信號途徑能夠通過RetS調(diào)控的小RNA RsmX和RsmZ在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控2，4-DAPG合成基因的表達[6]。此外，psrA基因則可能通過激活RpoS來抑制2，4-DAPG生物合成[7]。

越來越多的研究表明，群體效應(yīng)（Quorum-sensing，QS）系統(tǒng)也會影響2，4-DAPG的產(chǎn)生，mvaT、mvaV、hfq通過PcoI/PcoR系統(tǒng)調(diào)節(jié)生防菌2P24生物膜和2，4-DAPG的合成基因的表達水平，影響其在小麥根部的定殖和生防作用[8，9]。

2 2，4-DAPG在誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）中的作用

產(chǎn)2，4-DAPG的假單胞菌能夠誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性（ISR）。分子遺傳學(xué)證據(jù)表明，2，4-DAPG是誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性的關(guān)鍵分子[10]。通過對假單胞菌WCS417r誘導(dǎo)模式植物擬南芥的ISR過程進行研究后發(fā)現(xiàn)：WCS417r處理植物7 d后，植株根部有97個基因的表達水平發(fā)生了改變，接著在葉片接種丁香假單胞菌，相比于不用WCS417r菌株處理的對照組，WCS417r通過乙烯和茉莉酸依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)ISR相關(guān)基因表達[11，12]。

3 植物病害對2，4-DAPG的響應(yīng)方式研究

植物病原菌往往通過各種防御機制抵御外來不良環(huán)境因子。這些機制包括有害分子的酶分解機制、有害分子靶基因的突變進化機制、毒物的轉(zhuǎn)運外排機制等。Kwak等[13]使用模式生物釀酒酵母來模擬研究2，4-DAPG對植物真菌病害的作用機制。通過對突變體的遺傳學(xué)、生物化學(xué)的研究，該課題組發(fā)現(xiàn)細胞膜的通透性、活性氧水平的調(diào)控和細胞內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡均受2，4-DAPG作用影響，這暗示2，4-DAPG可作用于植物真菌病原菌的多種基本生理過程。

4 產(chǎn)2，4-DAPG假單胞菌的微生物生態(tài)學(xué)研究

Powers等[14]發(fā)現(xiàn)2，4-DAPG可以抑制枯草芽孢桿菌生物膜相關(guān)基因的表達，從而減緩其生物膜形成過程。這表明2，4-DAPG極可能在環(huán)境中對微生物群落結(jié)構(gòu)起調(diào)節(jié)作用。最近的研究結(jié)果表明，天然土壤中，產(chǎn)2，4-DAPG的假單胞菌所具有的抗菌廣譜活性是由地表植物群落組成和多樣性共同決定的[15]。水稻田間試驗表明，在土壤中施用甲胺磷會導(dǎo)致假單胞菌對水稻紋枯病的拮抗作用活性顯著下降，具有phlD基因的微生物多樣性和豐度會顯著降低。這表明，大量施用甲胺磷會通過破壞假單胞菌群落多樣性而增加植物感染紋枯病的風(fēng)險[16]。這些微生物生態(tài)學(xué)的研究為人們理解2，4-DAPG產(chǎn)生菌和植物病害之間的相互作用提供了新的理論依據(jù)，也為其生防應(yīng)用提供了新的思路[15]。

5 產(chǎn)2，4-DAPG的熒光假單胞菌的應(yīng)用研究

利用產(chǎn)2，4-DAPG的熒光假單胞菌進行農(nóng)業(yè)病害防治的經(jīng)典案例是小麥全蝕病的防治。全蝕病是全球范圍內(nèi)小麥最嚴(yán)重的根部病害。研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌株產(chǎn)生的廣譜抗生素2，4-DAPG可顯著抑制全蝕病病原菌Gaeumannomyces graminis var. tritici。在小麥全蝕病衰退的土壤中可以檢測到大量的2，4-DAPG產(chǎn)生細菌[10]?？梢韵胂?，多年甚至幾十年來，Gaeumannomyces graminis var. tritici都一直面對2，4-DAPG這一“敵人”，但科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在這些土壤中，抵抗和耐受2，4-DAPG的全蝕病原菌卻始終沒有出現(xiàn)，甚至在長期小麥單作的田間也沒有出現(xiàn)。產(chǎn)2，4-DAPG的假單胞菌在抑制煙草根黑腐病、番茄根腐病、黃瓜猝倒病、水稻穗枯病、紅辣椒疫病等病害中都能有效發(fā)揮作用[17，18]。

產(chǎn)2，4-DAPG的假單胞菌高效防控植物病害的原因可能包括：①2，4-DAPG作用于多個細胞過程使其攻擊病原菌的途徑具有多樣化，病原菌出現(xiàn)抗逆性幾乎不可能；②病原菌只有在假單胞菌增殖的寄生階段才會被暴露在高濃度的2，4-DAPG中，而在病原菌其他的生活環(huán)境中并不存在，它們以腐生的方式生活在根際，此時環(huán)境中的2，4-DAPG濃度極低。因此降低了對病原菌的選擇壓力[10]。

6 問題與展望

雖然理論上熒光假單胞菌通過產(chǎn)生2，4-二乙?；g苯三酚（2，4-DAPG）具有抑制多種病害的潛力，但在實際應(yīng)用過程中也存在一些問題，例如氣候、土壤條件、土壤微生物功能群本身的因素可能加速病害的傳播、抑制生防作用效果；另一方面，誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生對病原菌的系統(tǒng)抗性受植物種類、植物生理階段及外界環(huán)境條件的影響較大[19]。因此在制定生物防治策略的過程中，應(yīng)結(jié)合作物輪作、增施有機肥、改善土壤微生物功能群等綜合措施。

參考文獻：

[1] MOYNIHAN J A， MORRISSEY J P， COPPOOLSE E R， et al. Evolutionary history of the phl gene cluster in the plant-associated bacterium Pseudomonas fluorescens[J]. Appl Environ Microbiol，2009，75（7）：2122-2131.

[2] ACHKAR J， XIAN M， ZHAO H， et al. Biosynthesis of phloroglucinol[J]. J Am Chem Soc，2005，127（15）：5332-5333.

[3] TIAN T， WU X G， DUAN H M， et al. The resistance-nodulation-division efflux pump EmhABC influences the production of 2，4-diacetylphloroglucinol in Pseudomonas fluorescens 2P24[J]. Microbiology，2010， 156（1）：39-48.

[4] POTVIN E， SANSCHAGRIN F， LEVESQUE R C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa[J]. FEMS Microbiol Rev， 2008， 32（1）：38-55.

[5] ZHANG W， ZHAO Z， ZHANG B， et al. Posttranscriptional regulation of 2，4-diacetylphloroglucinol production by GidA and TrmE in Pseudomonas fluorescens 2P24[J]. Appl Environ Microbiol，2014，80（13）：3972-3981.

[6] 劉九成，張 偉，吳小剛，等.熒光假單胞菌2P24中retS對抗生素2，4-二乙酰基間苯三酚合成的影響[J].微生物學(xué)報，2013， 53（2）：118-126.

[7] WU X， LIU J， ZHANG W， et al. Multiple-level regulation of 2，4-diacetylphloroglucinol production by the sigma regulator PsrA in Pseudomonas fluorescens 2P24[J]. PLoS One，2012，7：e50149.

[8] 吳小剛，魏亞蕊，劉九成，等.生防假單胞菌2P24中mvaT和mvaV基因?qū)coI/PcoR群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用[J].微生物學(xué)報，2012，52（6）：710-717.

[9] WU X G， DUAN H M， TIAN T， et al. Effect of the hfq gene on 2，4-diacetylphloroglucinol production and the PcoI/PcoR quorum-sensing system in Pseudomonas fluorescens 2P24[J]. FEMS Microbiol Lett， 2010， 309（1）：16-24.

[10] KWAK Y S， WELLER D M. Take-all of wheat and natural disease suppression： A Review[J]. Plant Pathol J，2013，29（2）： 125-135.

[11] VERHAGEN B W， GLAZEBROOK J， ZHU T， et al. The transcriptome of rhizobacteria-induced systemic resistance in arabidopsis[J]. Mol Plant Microbe Interact，2004，17（8）：895-908.

[12] WELLER D M， MAVRODI D V， PIETERSE C M， et al. Induced systemic resistance in Arabidopsis thaliana against Pseudomonas syringae pv. tomato by 2，4-diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas fluorescens[J]. Phytopathology， 2012， 102（4）：403-412.

[13] KWAK Y S， HAN S， THOMASHOW L S， et al. Saccharomyces cerevisiae genome-wide mutant screen for sensitivity to 2，4-diacetylphloroglucinol， an antibiotic produced by Pseudomonas fluorescens[J]. Appl Environ Microbiol，2011，77（5）：1770-1776.

[14] POWERS M J， SANABRIA-VALENT？魱N E， BOWERS A A， et al. Inhibition of cell differentiation in Bacillus subtilis by Pseudomonas protegens[J]. Journal of Bacteriology，2015， pii： JB.02535-14.

[15] JOUSSET A， BECKER J， CHATTERJEE S， et al. Biodiversity and species identity shape the antifungal activity of bacterial communities[J]. Ecology， 2014， 95（5）：1184-1190.

[16] WU M， LI X， ZHANG H， et al. Effects of methamidophos on the community structure， antagonism towards Rhizoctonia solani， and phlD diversity of soil Pseudomonas[J]. J Environ Sci Health B， 2010， 45（3）：222-228.

[17] WELLER D M， RAAIJMAKERS J M， GARDENER B B， et al. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens[J]. Annu Rev Phytopathol， 2002， 40：309-348.

[18] KIM S D， FUENTE LDE L， WELLER D M， et al. Colonizing ability of Pseudomonas fluorescens， among collections of 2，4-diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas fluorescens spp. in pea rhizosphere[J]. J Microbiol Biotechnol，2012，22（6）：763-770.

[19] 李興龍，李彥忠.土傳病害生物防治研究進展[J].草業(yè)學(xué)報，2015，24（3）：204-212.