HPLC法測(cè)定雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬的含量及其脂水分配系數(shù)

許崇搖 蔣偉哲 黃興振

[摘要] 目的 建立雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬的含量測(cè)定方法以及測(cè)定其脂水分配系數(shù)（LogP）。 方法 采用HPLC法和搖瓶法（正辛醇/水體系），Synergi Fusion-RP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm）；流動(dòng)相為水-甲醇（25∶75，V∶V）；流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長226 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量為20 μL。 結(jié)果 雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬質(zhì)量濃度在8.5～340 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，r=0.9999，平均回收率為99.81%，RSD為0.36%（ n = 6）。樣品平均含量為98.26%，其LogP約為1.4。 結(jié)論 該檢測(cè)方法準(zhǔn)確、簡便，精密度高，可用于雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬酯的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法；雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬酯；脂水分配系數(shù)；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）03（c）-0149-04

[Abstract] Objective To establish a method for determine the content and partition coefficient （LogP） of diacetyl L-dopa methylester ibuprofen. Methods Shaking-flask method （n-Octanol/water system） and HPLC method were used. The Synergi Fusion-RP C18 column （4.6 mm×250 mm， 4 μm） was used and the mobile phase was H2O-CH3OH （25∶75，V∶V）， the flow rate was 0.8 mL/min. The detection wavelength was 226 nm. The column temperature was 40℃ and the injective volume was 20 μL. Results A good linear relationship was observed in the concentration range of 8.5-340 μg/mL， with the correlation coefficient of 0.9999. The average recovery rate was 99.81% and RSD was 0.36% （n=6）. The average content of diacetyl L-dopa methylester ibuprofen was 98.26%， and the LogP was about 1.4. Conclusion The determination method was accurate and sensitive with high precision， which can be applicable for the content assay of diacetyl L-dopa methylester ibuprofen.

[Key words] HPLC method； Diacetyl L-dopa methylester ibuprofen； Partition coefficient； Content determination

帕金森病是一種腦內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元病變?yōu)樘卣鞯纳窠?jīng)元退化性疾病[1-2]，目前臨床藥物治療仍以左旋多巴（L-dopa）為主，但是L-dopa在治療過程中會(huì)引起較多的副作用和生物利用度低等問題[3-5]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，布洛芬每周服用2～3次，患帕金森病的高齡人發(fā)生率減少30%左右；雖然布洛芬減少患帕金森病發(fā)病率的機(jī)制尚不清楚，但是目前認(rèn)為，這可能與布洛芬的抗炎作用有利于降低導(dǎo)致帕金森病的細(xì)胞死亡有關(guān)[6]。這一發(fā)現(xiàn)將有助于帕金森病新治療藥物的研發(fā)。雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬（diacetyl L-dopa methylester ibuprofen）為L-dopa與布洛芬拼合得到的一個(gè)潛在的治療帕金森病的酰胺化合物，其化學(xué)名為4-[（2S）-2-（2-（4-異丁苯基）丙酰胺基]-3-甲氧基-3-氧代丙基）-1，2-苯二乙酸酯[4-（（2S）-2-（2-（4 -isobutylphenyl）propanamido）-3-methoxy-3-oxopropyl）-1，2-phenylene diacetate]，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。為了對(duì)雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬作進(jìn)一步的研究和開發(fā)，筆者建立了其含量測(cè)定方法，并用HPLC法檢測(cè)了其脂水分配系數(shù)（LogP），該法可用于其質(zhì)量控制和檢測(cè)分析，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試劑

EL204梅特勒-托利電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；LC20AVP高效液相色譜儀（日本島津公司）；SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（金壇市易晨儀器制造有限公司）；甲醇（Fisher公司，色譜純，批號(hào)：111773）；蒸餾水自制；其他試劑均為分析純；雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬樣品（批號(hào)分別為20120101， 20120102和20120103），雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬對(duì)照品（經(jīng)純化精制，其純度為98.80%，百分歸一化法）由實(shí)驗(yàn)室合成精制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Synergi Fusion-RP80A C18柱（4.6 mm×250 mm，4 μm），流動(dòng)相使用水-甲醇（25∶75，V∶V），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長為226 nm，柱溫40℃，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 樣品溶液配制 取雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬對(duì)照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，以流動(dòng)相溶解，定容至刻度，搖勻，配制成濃度約為340 μg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。取雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬樣品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，以流動(dòng)相溶解，定容至刻度，搖勻，配制成濃度約為136 μg/mL的供試品溶液，備用。以流動(dòng)相作為空白對(duì)照溶液。

2.2.2 緩沖溶液配制 pH值1.3緩沖液：取0.2 mol/mL KCl 25 mL和0.2 mol/L HCl 33.6 mL，混合再加蒸餾水稀釋至100 mL，即得。

pH值5.0緩沖液：取0.2 mol/mL的NaH2PO4溶液，用NaOH試液調(diào)pH值至5.0，即得。（NaOH試液：NaOH 4.3 g，加水溶解成100 mL，即得。）

pH值7.4緩沖液：取KH2PO4 1.36 g，加0.1 mol/mL NaOH溶液79 mL用蒸餾水稀釋至200 mL，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下方法配制對(duì)照品和樣品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示，供試品溶液（圖2B）色譜峰與雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬對(duì)照品溶液（圖2A）色譜峰保留時(shí)間相一致，空白對(duì)照溶液（圖2C）顯示無干擾，理論塔板數(shù)以雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬峰計(jì)不低于5000，見圖2。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品貯備溶液（340 μg/mL）10、8、4、2、1、0.5、0.25 mL，置于10 mL容量瓶，以流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制得濃度分別為340、272、204、136、68、34、17、8.5 μg/mL的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜峰面積，以雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y= 29 172X + 32 001，r =0.9999。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取濃度為136 μg/mL的對(duì)照品溶液按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，以峰面積考察其日內(nèi)精密度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，平均峰面積為4 034 815.3，RSD為0.39%（n = 6），表明儀器進(jìn)樣精密度較好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取濃度為136 μg/mL的對(duì)照品溶液每隔一定時(shí)間（0、2、4、8、12 h）進(jìn)樣20 μL測(cè)定，每次測(cè)定2針，平均峰面積為4 034 504.5，RSD為0.59%（n = 5），試驗(yàn)表明對(duì)照品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品（批號(hào)：20120102），按供試品溶液的配制方法平行配制3份，按色譜條件方法測(cè)定結(jié)果，3份樣品測(cè)定平均值為98.20%，RSD為0.04%（n = 3），表明重復(fù)性良好。

2.3.6加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬樣品約10 mg（批號(hào)：20120101）6份，精密稱定，置100 mL容量瓶中，每兩份中分別精密加入干燥至恒重的對(duì)照品約8、10、12 mg，以流動(dòng)相溶解，定容至刻度，搖勻。按色譜條件方法測(cè)定，計(jì)算回收率[7-8]。結(jié)果，平均回收率為99.81%，RSD為0.36%（n = 6），表明加樣回收結(jié)果符合要求。結(jié)果見表1。

2.3.7 定量限及檢測(cè)限 在該色譜條件下，按信噪比（S/N）為3和10分別對(duì)檢測(cè)限和定量限進(jìn)行測(cè)定。對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣，測(cè)定結(jié)果顯示，濃度為15.2 μg/mL進(jìn)樣量為0.1 μL時(shí)，主峰信號(hào)約為噪音信號(hào)的3倍；進(jìn)樣量為0.3 μL時(shí)，主峰信號(hào)約為噪音信號(hào)的10倍，即最低檢測(cè)限和定量限分別為1.52、4.56 ng。

2.3.8 脂水分配平衡時(shí)間考察 稱取雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬約5 mg，加正辛醇（水飽和）于250 mL容量瓶中溶解，定容。取20 mL含樣品的正辛醇（水飽和）溶液至錐形瓶，加入20 mL蒸餾水（正辛醇飽和），加塞密封，同樣處理5份，置25℃水浴恒溫振蕩器分別劇烈振搖0.25、0.5、1、1.5、2 h，轉(zhuǎn)入分液漏斗中靜置，分離出水相和有機(jī)相，以水相進(jìn)樣20 μL，當(dāng)含量不再增減時(shí)，即為平衡時(shí)間[9-11]。結(jié)果，振搖1 h時(shí)達(dá)到分配平衡。

3 結(jié)果

3.1 樣品含量測(cè)定

稱取3批樣品分別約為10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜峰；另取對(duì)照品溶液，同法操作，以外標(biāo)法峰面積計(jì)算。結(jié)果顯示，批號(hào)為20120101、 20120102和20120103樣品雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬的含量分別為98.40%、98.18%、98.20%，平均含量為98.26%。

3.2 LogP的測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下“脂水分配平衡時(shí)間考察”方法，準(zhǔn)確量取20 mL含雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬的正辛醇（水飽和）溶液至錐形瓶，加20 mL蒸餾水、pH值7.4緩沖液、pH值5.0緩沖液和pH值1.3緩沖液（分別用正辛醇飽和），分別平行操作2份，加塞密封后振搖1 h（25℃），轉(zhuǎn)入分液漏斗中靜置，分離出水相和有機(jī)相，取有機(jī)層和水層溶液分別進(jìn)樣，檢測(cè)分析樣品濃度，計(jì)算不同pH值溶液下的脂水分配系數(shù)，計(jì)算公式為

4 討論

雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬的甲醇溶液（80 μg/mL）在200～400 nm波長范圍內(nèi)光譜掃描，有兩個(gè)最大吸收峰分別為210、226 nm，因此選取226 nm作為檢測(cè)波長；由于Synergi Fusion-RP 80A C18柱芯填充顆粒比較細(xì)（4 μm），柱溫在室溫時(shí)柱子壓力較高，柱溫在40℃條件下時(shí)柱壓較為理想，不影響結(jié)果的分析；流動(dòng)相采用水-甲醇（25∶75，V∶V），流速為0.8 mL/min時(shí)出峰時(shí)間大約為11 min。在該分析條件下，雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬的檢測(cè)限和定量限分別為1.52、4.56 ng，3批樣品的平均含量為98.26%。

正辛醇-水為有機(jī)化合物測(cè)定脂水分配系數(shù)方法常用的溶液體系，有機(jī)化合物具有合適的LogP將有利于機(jī)體的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)揮更好的療效[15]。筆者首先考察了雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬在正辛醇和水溶液中分配平衡時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在該實(shí)驗(yàn)條件下振搖60 min分配達(dá)到平衡。為了探討雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬在不同pH值緩沖溶液中的脂水分配情況[16-18]，筆者還采用了蒸餾水、pH值7.4緩沖液、pH值5.0緩沖液和pH值1.3緩沖液作為水相，分別測(cè)定分析其LogP，發(fā)現(xiàn)其LogP分別為1.44、1.45、1.66和1.44（25℃），說明該化合物在不同pH值溶液中均具有較高的脂溶性[19-20]。其在不同pH值緩沖溶液中的LogP略有差別，可能與雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬在不同pH值條件下的穩(wěn)定性情況不同有關(guān)。

本文建立了雙乙酰左旋多巴甲酯布洛芬的含量檢測(cè)方法，操作較為簡便、重復(fù)性好，可用于質(zhì)量控制和分析檢測(cè)以及反應(yīng)過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

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（收稿日期：2015-11-01 本文編輯：趙魯楓）