網(wǎng)狀纖維染色在臨床病理診斷中的應(yīng)用及技術(shù)

王曉燕 高俊巖 王艷霞

[摘要] 網(wǎng)狀纖維染色法是病理學(xué)傳統(tǒng)的特殊染色方法之一，在臨床病理學(xué)診斷及鑒別診斷中應(yīng)用廣泛。病理學(xué)診斷至今仍為臨床多種腫瘤性疾病明確診斷及分型等的金標(biāo)準(zhǔn)，網(wǎng)狀纖維染色法在多種腫瘤病理診斷中發(fā)揮重要的作用。網(wǎng)狀纖維的組織改變在臨床疾病病理診斷上有重要意義，如血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺纖維上皮腫瘤、胃腸道間皮瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等，但網(wǎng)狀纖維在染色過程中易出現(xiàn)問題，如纖維著色不良、纖維退色、染色背景過深等。本文就網(wǎng)狀纖維染色在臨床病理診斷中的應(yīng)用及技術(shù)作一綜述。

[關(guān)鍵詞] 網(wǎng)狀纖維；染色；腫瘤；病理診斷

[中圖分類號] R817.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0072-04

[Abstract] Reticular fiber staining is one of the classical method for special staining in pathology and has been wildly used in diagnosis and differential diagnosis of various diseases. Pathological diagnosis has been regarded as the golden standard in diagnosis and classification of many tumors， in which reticular fiber staining plays important roles. The changes of reticular fiber have important implications for clinical pathological diagnosis including hematological malignancies， fibro-epithelioma of breast， gastrointestinal mesothelioma， nervous system tumors， etc. However， in the process of reticular fiber staining， there may be some problems such as fiber coloring bad， fibrous degeneration and calcification， etc. This article reviews application of reticular fiber staining and common problems in the process of staining.

[Key words] Reticular fiber； Dyeing； Tumor； Pathological diagnosis

網(wǎng)狀纖維是網(wǎng)狀結(jié)締組織內(nèi)的一種纖維，由網(wǎng)狀細(xì)胞所產(chǎn)生。網(wǎng)狀纖維直徑為0.2～1.0 μm，纖細(xì)而有分支，穿行于網(wǎng)狀細(xì)胞體和細(xì)胞突之間，共同構(gòu)成網(wǎng)狀支架[1]。網(wǎng)狀纖維普通HE染色難以辨認(rèn)，缺乏彈性而有韌性，化學(xué)成分是網(wǎng)狀蛋白，是一種特殊類型的膠原蛋白，在膠原纖維上包有一層特殊的糖蛋白，使網(wǎng)狀纖維呈現(xiàn)嗜銀性的特點，所以網(wǎng)狀纖維又稱為嗜銀纖維，從而也利用網(wǎng)狀纖維的此種特點，用銀氨液浸染后用甲醛還原使網(wǎng)狀纖維變成黑色，從而顯示網(wǎng)狀纖維為黑色[2-3]。網(wǎng)狀纖維分布廣泛，以兩種形式存在，一種作為某些器官的網(wǎng)狀支架例如骨髓、脾、淋巴結(jié)、肝、胸腺和扁桃體等器官；另一種存在于上皮的基膜，同時平滑肌、脂肪細(xì)胞、毛細(xì)血管和神經(jīng)纖維都有網(wǎng)狀纖維包裹[4]。因此，網(wǎng)狀纖維染色在病理診斷中的應(yīng)用非常廣泛，組織中網(wǎng)狀纖維的多少和分布特點能給病理診斷提供重要的參考，纖維的粗細(xì)、疏密或有無斷裂對于判斷病變的性質(zhì)程度及其發(fā)展與轉(zhuǎn)歸具有重要意義[5]。雖然近年來免疫組化等技術(shù)的應(yīng)用，傳統(tǒng)的特殊染色方法逐漸被取代，網(wǎng)狀纖維染色的診斷價值被逐漸忽視。但網(wǎng)狀纖維染色法作為一種傳統(tǒng)的染色方法之一，其操作方便，價格便宜，耗材少，在許多疾病的診斷中仍發(fā)揮重要的作用，可作為病理診斷的重要手段。網(wǎng)狀纖維染色方法很多，如Gorden-Sweets染色法、Perdrau染色法、Foot染色法、Gomori染色法、Wilder染色法等方法，而Gomori網(wǎng)狀纖維染色是日常病理工作中最常用的網(wǎng)狀纖維染色法[6]。該法所需時間短，易于掌握，結(jié)果穩(wěn)定，但是多種因素仍然會對染色效果產(chǎn)生重要影響，在染色過程中若操作不當(dāng)極易造成染色效果不佳[6-7]。本文將對網(wǎng)狀纖維染色在臨床病理診斷中的應(yīng)用以及網(wǎng)狀纖維的染色機(jī)制和染色過程中易出現(xiàn)的問題進(jìn)行探討。

1 網(wǎng)狀纖維染色在病理診斷中的應(yīng)用

網(wǎng)狀纖維的組織改變在臨床疾病病理診斷上有重要意義，特別是在協(xié)助腫瘤診斷和鑒別診斷方面具有重大意義

1.1 血液系統(tǒng)疾病

許多血液系統(tǒng)疾病的臨床表現(xiàn)相似，最后診斷很多時候有賴于骨髓活檢，骨髓形態(tài)學(xué)改變是確診血液系統(tǒng)疾病的重要檢查方法，而網(wǎng)狀纖維染色的應(yīng)用在多種血液病的診斷與鑒別診斷中亦有輔助作用[8-10]。網(wǎng)狀纖維主要來源于間葉組織，血液系統(tǒng)屬于間葉組織，同時間葉組織來源的腫瘤細(xì)胞本身即可產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維，實驗結(jié)果[11]表明，在急性淋巴細(xì)胞性白血病（ALL）、急性髓細(xì)胞性白血病（AML）、多發(fā)性骨髓瘤（MM）、再生障礙性貧血（AA）、特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）、骨髓增生異常綜合征（MDS）、原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）、原發(fā)性血小板增多癥（ET）、骨髓轉(zhuǎn)移癌（BMT）等血液系統(tǒng)疾病中，網(wǎng)狀纖維陽性檢出率和/或網(wǎng)狀纖維密度結(jié)果具有明顯差異性，從而使網(wǎng)狀纖維染色在鑒別多種血液系統(tǒng)疾病中起到了重要作用。結(jié)果顯示，在以上血液系統(tǒng)疾病中，PMF陽性率最高，依次為BMT、MM、ET、ALL、MDS、AML、ITP、AA網(wǎng)狀纖維陽性率最低。由于網(wǎng)狀纖維可以由間葉腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，所以非腫瘤性血液系統(tǒng)疾病中網(wǎng)狀纖維產(chǎn)生較少，陽性率普遍偏低，最高者為增生性貧血，而ITP、AA網(wǎng)狀纖維陽性率最低。而網(wǎng)狀纖維密度結(jié)果顯示，密度為（+）者往往為良性血液病，無惡性血液系統(tǒng)疾病，如AA、ITP；結(jié)果≥（++）見于惡性血液系統(tǒng)疾病，如MDS、ALL、AML、MM、PMF以及BMT，其中PMF和BMT最高；結(jié)果≥（+++）者，良性血液病無，最高為PMF和BMT。同時結(jié)果也顯示ALL與AML、MM網(wǎng)狀纖維陽性率以及密度均有顯著差異。綜上所述在血液系統(tǒng)疾病的鑒別診斷中，網(wǎng)狀纖維染色也可以作為很好的參考指標(biāo)用于血液系統(tǒng)疾病的診斷。如患者臨床表現(xiàn)為外周血紅細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞減少，骨髓增生不良，可考慮為MDS或者是AA，通過網(wǎng)狀纖維染色，如果網(wǎng)狀纖維增多，密度≥（++），可以首先考慮MDS[12]。ALL與AML依靠形態(tài)學(xué)有時不易區(qū)分，通過網(wǎng)狀纖維染色，如網(wǎng)狀纖維增多首先考慮ALL。

1.2 乳腺纖維上皮腫瘤

最常見的乳腺纖維上皮性腫瘤包括乳腺纖維腺瘤和乳腺分葉狀腫瘤。乳腺纖維腺瘤是由乳腺上皮和纖維組織包括膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈力纖維按不同比例增生構(gòu)成；乳腺分葉狀腫瘤分為良性和惡性，良性和惡性之間纖維含量的豐富程度不同，但基本組織結(jié)構(gòu)與乳腺纖維腺瘤相似，也是由乳腺上皮和3種纖維組織構(gòu)成，而間質(zhì)的纖維成分的差異可以成為鑒別以上疾病的依據(jù)[13]。乳腺纖維腺瘤導(dǎo)管周圍堿質(zhì)中膠原纖維垂直于導(dǎo)管基底部而分葉狀腫瘤中膠原的膠原纖維系平行于導(dǎo)管周圍，兩者膠原纖維分布存在明顯差異。乳腺纖維上皮性腫瘤組織中均可發(fā)現(xiàn)在導(dǎo)管上皮的基膜處有完整的網(wǎng)狀纖維分布，而間質(zhì)中基本上均未見有網(wǎng)狀纖維成分，兩者網(wǎng)狀纖維分布無明顯差異。而乳腺纖維腺瘤，彈力纖維分布在血管壁周圍，由于乳腺分葉狀腫瘤缺乏瘤周包膜，因而也因血管稀少而缺乏彈力纖維。所以缺乏彈力纖維[13-15]。所以，結(jié)合膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈力纖維的組合染色結(jié)果，為診斷乳腺纖維上皮性腫瘤提供依據(jù)。

1.3 胃腸道間質(zhì)瘤

來源于胃腸道以梭形細(xì)胞為主的間葉源性腫瘤如平滑肌瘤、神經(jīng)鞘瘤與梭形細(xì)胞型間質(zhì)瘤在形態(tài)相似的情況下，采用網(wǎng)狀纖維染色，結(jié)果顯示平滑肌瘤瘤細(xì)胞間可見大量網(wǎng)狀纖維呈密集、束狀交叉排列，網(wǎng)狀纖維與瘤細(xì)胞平行走向[16]。神經(jīng)鞘瘤網(wǎng)狀纖維與瘤細(xì)胞平行分布，不包繞瘤細(xì)胞，穿行于在瘤細(xì)胞之間呈波浪狀排列。而間質(zhì)瘤瘤細(xì)胞之間可見大量呈疏松排列的網(wǎng)狀纖維，幾乎存在于每一個瘤細(xì)胞間并包繞瘤細(xì)胞，分布均勻，呈“蜘蛛網(wǎng)”樣分布。以上3種差異顯著的網(wǎng)狀纖維形態(tài)以及分布特征，對鑒別來源不同、但形態(tài)相似的胃腸道梭形細(xì)胞腫瘤具有臨床價值[17-19]。

1.4 垂體疾病

垂體是人體重要的內(nèi)分泌器官，其構(gòu)成分為腺垂體和神經(jīng)垂體兩部分。腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部由腺細(xì)胞構(gòu)成，腺細(xì)胞排列成索狀、巢狀或腺樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞之間具有豐富的竇狀毛細(xì)血管和網(wǎng)狀纖維等少量結(jié)締組織，網(wǎng)狀纖維染色可以清楚顯示腺泡和細(xì)胞索輪廓[20]。在垂體病變中，網(wǎng)狀纖維的形態(tài)和分布、增多或減少、斷裂或崩解等組織表變可能為垂體疾病的診斷和鑒別診斷提供有效的醫(yī)學(xué)診斷方式。垂體腺瘤是常見的垂體病變，通過網(wǎng)狀纖維染色發(fā)現(xiàn)在腺瘤內(nèi)缺乏網(wǎng)狀纖維，并且通過網(wǎng)狀纖維可以辨別腺瘤和正常垂體組織的界限，同時發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍的正常垂體組織內(nèi)網(wǎng)狀纖維因腺瘤的壓迫而變得致密。垂體卒中是大的垂體腺瘤發(fā)生內(nèi)出血或者各種原因?qū)е碌墓Ｈ勾贵w短期之內(nèi)體積迅速增大，通過HE染色，可見大片壞死以及出血病灶，缺乏特征性改變也無特異性檢測方法，而網(wǎng)狀纖維染色可以勾勒出腺瘤的輪廓，可以為垂體卒中的診斷提供依據(jù)。垂體的微腺瘤（直徑小于10 mm的垂體腺瘤）是亞臨床垂體腺瘤，發(fā)生率高，常見表現(xiàn)形式為Rathke囊腫合并微腺瘤[21]，臨床Rathke囊腫切除標(biāo)本，基本帶有正常垂體組織，由于組織小，難以判斷是否合并有微腺瘤，腺瘤內(nèi)無網(wǎng)狀纖維而正常垂體組織含有網(wǎng)狀纖維，因此通過網(wǎng)狀纖維染色可以判斷這種較常見的Rathke囊腫合并腺瘤。另外垂體增生，特別是垂體結(jié)節(jié)狀再生與垂體腺瘤在臨床癥狀、內(nèi)分泌學(xué)檢查結(jié)果以及影像學(xué)檢查方面不易區(qū)分[22]，通過網(wǎng)狀纖維染色，可以發(fā)現(xiàn)垂體增生腺泡擴(kuò)大，網(wǎng)狀纖維支架機(jī)構(gòu)完整，而垂體腺瘤內(nèi)的網(wǎng)狀支架破壞[23]。綜上所述，網(wǎng)狀纖維染色在垂體疾病，特別是垂體腺瘤的診斷和鑒別診斷中可以作為一種方便、實用的診斷方法。

1.5 其他

實驗性肝纖維化成過程中，通過對網(wǎng)狀纖維進(jìn)行動態(tài)染色，結(jié)果提示實驗用大鼠肝纖維化形成的不同階段，網(wǎng)狀纖維呈現(xiàn)出不同的特點，由此提示網(wǎng)狀纖維染色對判斷肝纖維化的形成具有一定參考價值[19]。有研究表明，癌巢周圍的網(wǎng)狀纖維形態(tài)可以反映出癌的生長和浸潤速度及機(jī)體的反應(yīng)。例如鼻咽癌癌巢周圍網(wǎng)狀纖維崩毀，提示癌組織在擴(kuò)展；如有網(wǎng)狀纖維包裹，則提示癌組織生長緩慢，預(yù)后較好[1]。在中樞系統(tǒng)疾病中，腦膜瘤病理形態(tài)多樣，組織類型多，容易與多種形態(tài)相似腫瘤混淆，特別是腦內(nèi)腦膜瘤易與膠質(zhì)瘤混淆，網(wǎng)狀纖維染色具有鑒別作用，前者富于網(wǎng)狀纖維而后者則無網(wǎng)狀纖維。在血管內(nèi)皮瘤和血管外皮瘤、骨惡性淋巴瘤和尤文肉瘤等疾病的鑒別中，網(wǎng)狀纖維染色也起到了重要作用[24]，本文不再詳細(xì)闡述。

2 網(wǎng)狀纖維染色技術(shù)探討

北京衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院（以下簡稱“我院”）病理檢驗技術(shù)教學(xué)和臨床病理實驗室網(wǎng)狀纖維染色常用Gomori法，一般需經(jīng)過氧化、漂白、媒染、浸銀、還原、調(diào)色、固定幾個步驟完成。該法易受多種因素影響，若在染色過程中不注意染色細(xì)節(jié)，易造成組織切片染色效果不佳。以下本文將對染色過程中易出現(xiàn)的問題及應(yīng)注意的細(xì)節(jié)進(jìn)行探討。

2.1 高錳酸鉀氧化

高錳酸鉀氧化可使網(wǎng)狀纖維內(nèi)糖蛋白中己糖毗鄰的羥基轉(zhuǎn)變?yōu)槿┗?，使網(wǎng)狀纖維的染色選擇性增強(qiáng)從而使網(wǎng)狀纖維突出顯示。單純使用高錳酸鉀也能氧化但速度慢，如果經(jīng)過濃硫酸酸化可加強(qiáng)高錳酸鉀的氧化作用，同時也能減弱細(xì)胞核對銀氨液的反應(yīng)，使銀浸染均勻一致，改善背景色調(diào)，利于后續(xù)胞核復(fù)染，從而改善染色效果。同時氧化的時間也是關(guān)鍵，一般為3～5 min。目前，我院病理檢驗技術(shù)教學(xué)和臨床病理實驗室酸化高錳酸鉀（5%）氧化時間為3 min，效果較好，經(jīng)氧化后的切片呈現(xiàn)棕色。本步驟中高錳酸鉀和硫酸應(yīng)等份混合，兩液分瓶盛裝放于4℃冰箱保存，臨用時放置室溫方可混合使用。高錳酸鉀常規(guī)使用濃度為5%，也有使用濃度為0.25%高錳酸鉀，染色效果較好[25]，可在今后的實際工作中加以摸索。

2.2 草酸漂白

由于草酸具有還原性，可使經(jīng)過高錳酸鉀氧化過的組織切片洗脫，使切片無色。草酸漂白的時間一般為1～2 min，但實際操作要以切片呈白色為度，漂白過度切片容易脫落，而漂白不足則不利于之后與銀的結(jié)合。文獻(xiàn)顯示[5]用1%過碘酸作為氧化劑，氧化4～5 min，可替代高錳酸鉀氧化和草酸漂白作用。本法可在今后的實際工作中加以實踐摸索。

2.3硫酸鐵銨媒染

媒染又稱為感應(yīng)，可以提高網(wǎng)狀纖維對銀鹽的親和力，使氨銀更易沉積在網(wǎng)狀纖維上，提高網(wǎng)狀纖維和背景的對比度，所以媒染時間必須充足，一般為5～15 min，媒染時間不足，將導(dǎo)致網(wǎng)狀纖維染色不良。我院病理檢驗技術(shù)教學(xué)和臨床病理實驗室目前媒染時間為10 min。

2.4 浸銀

浸銀后銀氨液中的二氨合銀離子[Ag（NH3）2+]與醛基結(jié)合，再經(jīng)甲醛液作用還原為黑色的金屬銀，從而使網(wǎng)狀纖維呈黑色。氨銀溶液的配制以及氨銀液染色時間是關(guān)鍵。配制氨銀溶液時，玻璃器皿必須十分清潔，而且需用雙蒸水，禁用自來水。配制好的溶液應(yīng)放置于棕色玻璃瓶中4℃冰箱保存，使用時間為4～8周。浸銀時間為30 s至數(shù)分鐘，最佳時間應(yīng)根據(jù)實際實驗環(huán)境進(jìn)行摸索確定，目前我院病理檢驗技術(shù)教學(xué)和臨床病理實驗室的浸銀時間為1 min。

2.5 甲醛的還原作用

甲醛是還原劑，能把結(jié)合在網(wǎng)狀纖維上的氨銀絡(luò)合物還原成棕黑色的金屬銀鍍在網(wǎng)狀纖維表面。甲醛的還原時間要嚴(yán)格控制不能過短也不能過長，否則染色效果不佳。

2.6 氯化金的調(diào)色作用

組織經(jīng)銀氨液浸染及甲醛還原后，經(jīng)氯化金作用可使多余的銀生成單質(zhì)金和白色的氯化銀沉淀，從而減少污染。調(diào)色時間一般為1～2 min，最好在顯微鏡下進(jìn)行，時間過長會引起纖維退色現(xiàn)象。

2.7 硫代硫酸鈉的固定作用

硫代硫酸鈉能清除未被甲醛還原和未與氯化金作用的銀，使切片著色固定清晰持久。

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（收稿日期：2015-12-15 本文編輯：任 念）