冬蟲夏草西洋參復(fù)合物增強(qiáng)免疫力功能實(shí)驗(yàn)研究

邱涵 呂曉君 張鵬

[摘要] 目的 研究冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠免疫功能的影響。 方法 將SPF級昆明種雌性小鼠200只隨機(jī)分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組動物分為陰性對照組和冬蟲夏草西洋參復(fù)合物高、中、低劑量組（0.9、0.6、0.3 g/kg）。陰性對照組給予蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d，每日1次。檢測冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、血清溶血素水平、抗體生成細(xì)胞數(shù)、小鼠碳廓清能力、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力及NK細(xì)胞活性等免疫指標(biāo)的影響。 結(jié)果 與陰性對照組比較，冬蟲夏草西洋參復(fù)合物高、中、低劑量組能明顯促進(jìn)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（P < 0.01），升高血清溶血素水平（P < 0.05或P < 0.01）；冬蟲夏草西洋參復(fù)合物中、低劑量組可顯著提高碳廓清能力（P < 0.05或P < 0.01），高、中劑量組可顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞活性（P < 0.05）；但冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組對小鼠體重、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、脾淋巴細(xì)胞增值轉(zhuǎn)化能力、抗體生成細(xì)胞數(shù)及巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞作用無明顯影響（P > 0.05）。 結(jié)論 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物具有增強(qiáng)小鼠免疫力的功能。

[關(guān)鍵詞] 冬蟲夏草；西洋參；免疫功能；小鼠

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0018-05

[Abstract] Objective To study the impact of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound on immunity function in mice. Methods A total of 200 SPF Kunming female mice were randomly divided into 5 batches， each of which consisted of negative control group and high， medium and low dosage （0.9， 0.6， 0.3 g/kg） of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound group. The negative control group was given distilled water， each mouse was orally administered once a day， for 30 days. The immune indexes including ConA-induced lymphocyte transformation ability， delayed type hypersensitivity， serum hemolysin level， antibody producing cell count， carbon clearance ability， macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes capacity and NK cell activity were detected. Results Compared with the negative control group， high， medium and low dosage of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound group could significantly strengthen the delayed type hypersensitivity of mice （P < 0.01）， increase the level of serum hemolysin （P < 0.05 or P < 0.01）. The medium and low dosage of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound group could significantly strengthen carbon clearance ability of mice （P < 0.05 or P < 0.01）， the high and medium dosage of Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound group could significantly strengthen NK cells activity of mice （P < 0.05）. However， Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound had no significant effects on body weight increase， ratio of spleen weight to body weight， ratio of thymus weight to body weight， lymphocyte transformation ability of mice induced by ConA and macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes capacity （P > 0.05）. Conclusion Cordyceps and Panacis Quinquefolii Radix Compound can enhance immunity function in mice.

[Key words] Cordyceps； Panacis Quinquefolii Radix； Immunity function； Mice

冬蟲夏草，又名蟲草，是我國特有的珍稀名貴藥材，其主要化學(xué)成分中的腺苷和多糖是冬蟲夏草生理活性最顯著的物質(zhì)，研究提示冬蟲夏草多糖和腺苷具有增強(qiáng)免疫力的作用[1-2]。西洋參，又名西洋人參、洋參、花旗參、廣東人參，其主要化學(xué)成分中的西洋參皂苷是生理活性最顯著的物質(zhì)，研究提示，西洋參皂苷和多糖等成分具有增強(qiáng)免疫力的作用[3-5]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，免疫力低下屬于中醫(yī)正氣不足的范疇，是由于正氣不足，身體各種功能下降，從而出現(xiàn)不能抵御外邪等一系列正虛的癥狀，其病機(jī)為正氣虛弱，多采用扶助正氣、固本培元法進(jìn)行治療[6-7]?！侗静菥V目拾遺》中記載冬蟲夏草具有滋補(bǔ)強(qiáng)身、補(bǔ)精益氣之功效，西洋參具有生津止渴、補(bǔ)血養(yǎng)陰、健脾益氣之功效。本研究依照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》[8]中有關(guān)增強(qiáng)免疫力功能的檢測方法，研究冬蟲夏草西洋參復(fù)合物是否具有增強(qiáng)免疫力的作用。

1 材料與方法

1.1 受試物

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物購自北京海德潤制藥有限公司（批號20141210），性狀為黃白色至淺灰色粉末。保存條件：密閉置于常溫干燥處，保質(zhì)期：24個(gè)月。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級昆明小鼠，200只，雌性，3周齡，體重18～22 g，由武漢生物制品研究所提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2012-0003。飼養(yǎng)條件：實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（鄂）2014-0009。光照為12 h明暗交替，溫度20～26℃，相對濕度40%～70%。

1.3 儀器與試劑

AB204-S電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；JM5102電子秤（余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；3K15臺式冷凍離心機(jī)（Sigma公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（SHEL-LAB公司）；ELX800酶標(biāo)儀（BIOTEK公司）；BX53顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；AU400全自動生化儀（日本OLYMPUS公司）。RPMI 1640培養(yǎng)基、刀豆蛋白A（ConA）、CCK-8、Hank液、二硝基氟苯（DNFB）、綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、印度墨汁、Na2CO3、雞紅細(xì)胞、YAC-1細(xì)胞、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及受試物給予方式 小鼠按體重隨機(jī)分為20組，每組10只。將20組小鼠分成5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的40只動物分為4組（冬蟲夏草西洋參復(fù)合物高、中、低劑量組及陰性對照組）。第1實(shí)驗(yàn)組：ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測定；第2實(shí)驗(yàn)組：遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）實(shí)驗(yàn)；第3實(shí)驗(yàn)組：血清溶血素測定和抗體生成細(xì)胞檢測；第4實(shí)驗(yàn)組：小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、胸腺和脾臟臟/體比值；第5實(shí)驗(yàn)組：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。設(shè)冬蟲夏草西洋參復(fù)合物高、中、低劑量分別為0.9、0.6、0.3 g/kg，相當(dāng)于人體推薦量的30、20、10倍劑量。臨用前用蒸餾水配制濃度為0.045、0.030、0.015 g/mL。各組小鼠灌胃體積為20 mL/kg。陰性對照組給予等體積蒸餾水。每天灌胃1次，連續(xù)30 d。

1.4.2 體重及淋巴器官臟器/體重比值測定 每周稱量所有動物體重，結(jié)束時(shí)處死小鼠。取出第4實(shí)驗(yàn)組小鼠的胸腺和脾臟，稱重并計(jì)算臟/體比值。臟/體（%）=臟器重量/動物體重×100%。

1.4.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）及NK細(xì)胞活性測定（LDH測定法） 末次給予受試樣品后，處死小鼠，無菌操作下取脾，研磨制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液后分成兩份（1號和2號），過200目篩網(wǎng)后Hank液洗2次，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至3×106個(gè)/mL（1號懸液）和2×107個(gè)/mL（2號懸液）。1號懸液用CCK-8法檢測經(jīng)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞的增殖能力；以2號懸液為效應(yīng)細(xì)胞，取對數(shù)生長期的YAC-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞終濃度至4×105個(gè)/mL作為靶細(xì)胞，依照LDH測定法進(jìn)行檢測，全自動生化分析儀檢測LDH含量，計(jì)算NK細(xì)胞活性。

1.4.4 二硝基氟苯誘導(dǎo)的小鼠DTH實(shí)驗(yàn)（耳腫脹法） 用1% DNFB致敏小鼠5 d后，再用1% DNFB刺激右耳，24 h后處死動物剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8 mm的耳片后分別稱重，以左右耳的重量之差來反映DTH的程度。

1.4.5 血清溶血素測定（血凝法）及抗體生成細(xì)胞檢測（Jerne改良玻片法） 將脫纖維處理后的羊血用生理鹽水洗滌3次，1500 r/min離心10 min。每只鼠經(jīng)腹腔注射2%（V/V）SRBC 0.2 mL進(jìn)行免疫。第5天按“血凝法”標(biāo)準(zhǔn)觀察血球凝集程度進(jìn)行血清溶血素的測定，計(jì)算抗體水平。隨后處死小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。按“Jerne改良玻片法”標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)，以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示抗體生成細(xì)胞數(shù)。

1.4.6 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn) 末次給予受試物后，稱體重，從小鼠尾靜脈10 mL/kg注入稀釋4倍的印度墨汁，注入后2、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即加到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。以0.1% Na2CO3溶液作空白對照，酶標(biāo)儀檢測600 nm波長處的OD值。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，稱重，計(jì)算吞噬指數(shù)。

1.4.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（滴片法） 每只小鼠腹腔注射2%（V/V）SRBC 0.2 mL。96 h后頸椎脫臼處死小鼠，按“滴片法”檢測，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA，方差齊性采用Dunnett檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)）和非參數(shù)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠體重的影響

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組小鼠整個(gè)試驗(yàn)過程中體重與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠淋巴器官臟器/體重比值的影響

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重比值與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對ConA誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組小鼠加ConA孔與不加ConA孔OD的差值，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說明其不能增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力，判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性。見表3。

2.4 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH反應(yīng)的影響

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組均能促進(jìn)小鼠對DNFB誘發(fā)的DTH反應(yīng)，與陰性對照組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。見表4。

2.5 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠抗體生成細(xì)胞的影響

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組的溶血空斑數(shù)與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說明其不能增強(qiáng)抗體生成細(xì)胞能力，判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性。見表5。

2.6 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠血清溶血素抗體水平的影響

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組均能升高血清溶血素水平，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。見表6。

2.7 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠碳廓清功能的影響

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物中、低劑量組可提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。見表7。

2.8 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組均不能提高吞噬率和吞噬指數(shù)，與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表8。

2.9 冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

冬蟲夏草西洋參復(fù)合物高、中劑量組能增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），判定該實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。見表9。

3 討論

免疫是機(jī)體對一切異物或抗原性物質(zhì)進(jìn)行非特異或特異性識別和排斥清除的一種生理學(xué)功能[9]，主要包括細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞功能四大方面[10-11]。大量研究提示，冬蟲夏草能夠活化NK細(xì)胞[12]，T、B細(xì)胞[13-14]以及單核-巨噬細(xì)胞[15-16]等特異性或者非特異性淋巴細(xì)胞，從而起到對機(jī)體的免疫保護(hù)作用[17]。國內(nèi)外學(xué)者也提示了西洋參多糖具有明顯的提高免疫力的作用[18-20]，為驗(yàn)證兩者合用對機(jī)體是否具有免疫調(diào)節(jié)功能，本研究從細(xì)胞免疫、體液免疫、吞噬功能、NK細(xì)胞功能檢測冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠免疫功能的影響，并觀察其對動物體重和免疫器官的影響，結(jié)果顯示：DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH實(shí)驗(yàn)中，冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組左右耳片重量差值與陰性對照組比較有顯著性差異，可促進(jìn)小鼠DTH；血清溶血素測定實(shí)驗(yàn)中，冬蟲夏草西洋參復(fù)合物各劑量組抗體水平與陰性對照組比較差異有顯著性意義，可提高血清溶血素水平；碳廓清實(shí)驗(yàn)中，冬蟲夏草西洋參復(fù)合物中、低劑量組吞噬指數(shù)與陰性對照組比較差異有顯著性意義，可提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力；NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)中，冬蟲夏草西洋參復(fù)合物高、中劑量組LDH含量與陰性對照組比較差異有顯著性意義，可增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性。

機(jī)體的免疫作用主要通過激活巨噬細(xì)胞、促進(jìn)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化、提高B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，同時(shí)激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)等來完成[20]。DTH是T細(xì)胞介導(dǎo)的一種超敏反應(yīng)，用變應(yīng)原（DNFB）刺激小鼠時(shí)T淋巴細(xì)胞會增殖成致敏淋巴細(xì)胞，部分還會分化成記憶細(xì)胞，當(dāng)再次用同種變應(yīng)原刺激時(shí)，記憶細(xì)胞會迅速增殖，發(fā)生以單核細(xì)胞浸潤為主的炎性反應(yīng)，屬于細(xì)胞免疫應(yīng)答功能；血清溶血素測定是B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗SRBC抗體使致敏紅細(xì)胞溶解的溶血反應(yīng)，屬于體液免疫應(yīng)答功能；巨噬細(xì)胞可通過直接吞噬外來異物或自身衰老的細(xì)胞來發(fā)揮提高機(jī)體免疫力的作用，當(dāng)墨汁被注入到小鼠尾靜脈血液中，血液中的外周血單核巨噬細(xì)胞會吞噬異物顆粒，可用巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)反映其吞噬能力；活細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有LDH，NK細(xì)胞具有自然殺傷活性及抗腫瘤作用，當(dāng)YAC-1細(xì)胞（小鼠淋巴瘤細(xì)胞）受到NK細(xì)胞殺傷后，LDH釋放到細(xì)胞外，因此通過檢測細(xì)胞上清液的LDH含量來反映NK細(xì)胞的活性。因此，本研究結(jié)果提示，冬蟲夏草西洋參復(fù)合物對小鼠細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、吞噬功能和NK細(xì)胞活性均有增強(qiáng)作用，促進(jìn)了小鼠的特異性免疫和非特異性免疫。根據(jù)《保健食品功能學(xué)評價(jià)程序和檢驗(yàn)方法》中增強(qiáng)免疫力實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為冬蟲夏草西洋參復(fù)合物具有增強(qiáng)免疫力的作用。

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（收稿日期：2015-12-23 本文編輯：張瑜杰）