• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    STAT3、Nanog基因在食管癌組織中的表達(dá)及臨床病理特征相關(guān)性

    2016-10-19 05:34:30馮笑山高社干周福有王能超楊海軍
    食管疾病 2016年3期
    關(guān)鍵詞:精原細(xì)胞免疫組化食管癌

    陸 曉,馮笑山,高社干,周福有,王能超,楊海軍

    ?

    STAT3、Nanog基因在食管癌組織中的表達(dá)及臨床病理特征相關(guān)性

    陸曉1,馮笑山1,高社干1,周福有2,王能超2,楊海軍2

    目的探索STAT3、Nanog基因在食管癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性,為食管癌基因治療尋找新的靶點(diǎn)。方法選取2014年河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院安陽市腫瘤醫(yī)院食管癌50例為研究對(duì)象。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)食管癌癌組織與癌旁組織中STAT3、Nanog mRNA的表達(dá);同時(shí)聯(lián)合運(yùn)用Western blot 技術(shù)與免疫組化技術(shù)檢測(cè)STAT3、Nanog蛋白在食管癌及癌旁組織的定位與表達(dá)。結(jié)果食管癌組織中STAT3、Nanog的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05);STAT3和Nanog在低分化食管癌組織中的表達(dá)明顯高于其他分化程度(P<0.05),無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌組織中STAT3、Nanog的陽性表達(dá)率低于伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(P<0.05),無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌組織中的STAT3、Nanog陽性率明顯低于伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌組織(P<0.05)。食管癌組織中STAT3和Nanog的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.303,P<0.05)。結(jié)論STAT3、Nanog基因可能在食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮重要作用,其可能成為食管癌基因診斷和治療的新靶點(diǎn)。

    食管癌;STAT3;Nanog;RT-PCR;Western blot;免疫組化

    食管癌是嚴(yán)重威脅人類生命的常見惡性腫瘤之一,其致死率為世界第6位[1]。尋找和確定食管癌發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的基因、蛋白等關(guān)鍵環(huán)節(jié),有助于對(duì)食管癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步認(rèn)識(shí),并將其應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防、早期診斷與治療。研究發(fā)現(xiàn)Nanog基因在囊胚內(nèi)細(xì)胞群、原始生殖細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESCs)中高表達(dá),維持細(xì)胞多能性和自我更新,致使其獲得增殖及永生能力的分子基礎(chǔ)[2-3]。而STAT3是JAK-STAT信號(hào)通路家族的重要成員,它既是核轉(zhuǎn)錄因子,也是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,其參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、免疫反應(yīng)、惡性轉(zhuǎn)化、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃避等[4]。有報(bào)道稱Nanog可能是STAT3途徑的一個(gè)直接靶基因,它們可能具有協(xié)同或交互作用[5-6]。本文現(xiàn)采用免疫組化SP法(streptavidin peroxidase conjugated method,SP)、Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)食管癌及癌旁組織中STAT3和Nanog的表達(dá),探討二者在食管癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用及其與食管癌臨床病理之間的相互關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1標(biāo)本來源選取2014年河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院安陽市腫瘤醫(yī)院食管癌切除標(biāo)本50例,年齡(61.50±15.30)歲。高分化鱗癌14例,中分化鱗癌17例,低分化鱗癌19例。根據(jù)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)判斷,腫瘤浸潤(rùn)深度:T1 16例、T2 12例、T3 14 例、T4 8例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例;伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移24例。癌旁組織為食管癌手術(shù)切除標(biāo)本中距癌組織邊緣3~5 cm的食管組織。選取同時(shí)期10例STAT3和Nanog陽性表達(dá)的睪丸精原細(xì)胞瘤作免疫組化的陽性對(duì)照。

    1.2免疫組織化學(xué)分析

    1.2.1主要試劑兔抗人Nanog多克隆抗體(濃度1∶1 000)、兔抗人STAT3單克隆抗體(1∶1 000)均購自武漢三鷹公司;SP試劑盒和DAB 酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

    1.2.2方法免疫組化染色采用SP法嚴(yán)格按試劑說明操作。

    1.2.3結(jié)果判斷Nanog和STAT3表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和(或)胞膜,按染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)所占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)分。染色強(qiáng)度:細(xì)胞未染色為0 分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色3分;陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分,11%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分;將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘:0~7分為陰性,≥8分為陽性。兩位高年資病理醫(yī)師雙盲讀片。

    1.3Western blotting實(shí)驗(yàn)

    1.3.1主要試劑兔抗人Nanog多克隆抗體(濃度1∶1 000)、兔抗人STAT3單克隆抗體(1∶1 000)均購自武漢三鷹公司,預(yù)染Marker。凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、電泳儀均購自BIO-RAD公司(美國(guó))。

    1.3.2方法

    1.3.2.1SDS-PAGE電泳①配制12%分離膠和5%的濃縮膠,制備SDS-PAGE緩沖液;②將備用變性的組織蛋白上樣;③電泳:濃縮膠80 V,30 min;分離膠120 V,90 min??倳r(shí)間約為120 min。

    1.3.2.2轉(zhuǎn)膜按從陽極到陰極的順序依次放置:海綿、3 M濾紙、PVDF膜、凝膠、3 M濾紙、海綿;加入轉(zhuǎn)膜液,低溫、恒壓90 V,l.5 h;用含5%脫脂牛奶的封閉緩沖液室溫下封閉1 h。

    1.3.2.3免疫反應(yīng)嚴(yán)格按試劑盒說明操作。

    1.3.2.4化學(xué)顯影和定影①在暗室中,將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中試劑A和試劑B在保鮮膜上等體積混合,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸l min,然后將PVDF膜移至另一保鮮膜上,移去殘液,包好。②放入凝膠成像系統(tǒng)機(jī)中曝光,以tublin作為內(nèi)參照,進(jìn)行凝膠圖像分析,應(yīng)用灰度分析軟件(ImageJ軟件)對(duì)Nanog和STAT3條帶進(jìn)行灰度值的比值對(duì)比分析。

    1.4RT-PCR

    1.4.1主要試劑Nanog引物、STAT3引物、GAPDH引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自生工生物工程技術(shù)有限公司(上海)。PCR擴(kuò)增儀購自百泰克生物技術(shù)有限公司(北京)。

    1.4.2方法Trizol法提食管組織總RNA,取<1 pg的RNA用M-M LV酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以所得cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。Nanog的上游引物:5’-AATAACCTTGGCTGCCGTCTC-3’,下游引物:5’-AGCCTCCCAATCCCAAACAAT-3’。STAT3上游引物:5’-ACACCGTAAGTGGCTTCCTT-3’,下游引物:5’-CTCTCACCCAGTGTCCCATTC-3’。GAPDH的上游引物:5’-GCCACATCGCTCAGACACC-3’,下游引物:5’-GATGGCAACAATATCCACTTTACC-3’。建立20 μL PCR 反應(yīng)體系:2xSuperReal PreMix Plusc DNA10 μL、cDNA 2 μL、Nanog(或STAT3)正反引物各0.5 μL(或GAPDH正反引物0.5 μL),95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火/延伸32 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。用GAPDH mRNA為內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照校正,各樣本的Nanog(或STAT3)基因擴(kuò)增量與GAPDH基因擴(kuò)增量采用Y=2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA水平Nanog和STAT3的相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果

    2.1食管癌中Nanog和STAT3的表達(dá)食管癌癌組織及癌旁組織中 Nanog和STAT3在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),見圖1。Nanog、STAT3在食管癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。因睪丸精原細(xì)胞瘤生物學(xué)特性與干細(xì)胞特性類似,將睪丸精原細(xì)胞瘤中的基因表達(dá)免疫組化結(jié)果作為陽性對(duì)照。

    A.食管癌組織中Nanog的表達(dá) B.癌旁組織中Nanog的表達(dá) C.精原細(xì)胞瘤中Nanog的表達(dá) D.食管癌組織中STAT3的表達(dá) E.癌旁組織中STAT3的表達(dá) F.精原細(xì)胞瘤中STAT3的表達(dá)圖1 Nanog、STAT3的表達(dá)

    2.2Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果凝膠成像以48 kDa的tublin為內(nèi)參,應(yīng)用灰度分析軟件(ImageJ軟件)對(duì)目的蛋白條帶的灰度值的比值進(jìn)行分析。結(jié)果顯示目的蛋白Nanog、STAT3在食管癌組織中高表達(dá),癌旁組織中低表達(dá),與免疫組化結(jié)果相一致,見圖2。

    T.癌組織 N.癌旁組織圖2 Nanog、STAT3蛋白表達(dá)凝膠成像對(duì)比

    2.3RT-PCR結(jié)果癌組織中的Nanog和STAT3擴(kuò)增量大于癌旁組織中的擴(kuò)增量,說明Nanog與STAT3在食管癌癌組織中比其癌旁組織中的表達(dá)量高,見圖3。

    A.Nanog mRNA擴(kuò)增 B.STAT3 mRNA擴(kuò)增圖3 Nanog、STAT3組織中的mRNA擴(kuò)增情況

    2.4Nanog與STAT3與食管癌臨床病理特征Nanog與STAT3在低分化食管癌組中的表達(dá)明顯高于高+中分化癌組(P<0.05);無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌組織中二者陽性率明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管癌組織(P<0.05),見表2。食管癌組織中Nanog和STAT3的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.303,P<0.05)。

    表2 Nanog和STAT3與食管癌臨床特征 例(%)

    3 討論

    Nanog為ESCs中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,是ESCs自我更新和多潛能性的重要調(diào)控因子[7],在胚胎外胚層維持多能性方面發(fā)揮的作用較為關(guān)鍵[8]。ESCs的多潛能性的維持可能與Nanog調(diào)控分化一些相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如STAT3的活性有關(guān)[9]。到目前為止,研究者對(duì)Nanog、STAT3在胚胎癌細(xì)胞和生殖細(xì)胞腫瘤中的作用所做的科研工作較多[10],發(fā)現(xiàn)兩者在睪丸癌、胚胎性腫瘤和精原細(xì)胞瘤組織中表達(dá)量較高[11]。而且除了生殖類腫瘤外,Nanog、STAT3在體細(xì)胞實(shí)體腫瘤方面發(fā)揮的作用也逐漸受到關(guān)注,在乳腺癌、腦部腫瘤、骨肉瘤和膀胱癌腫瘤組織中存在與干細(xì)胞特性類似的細(xì)胞團(tuán),在這些細(xì)胞團(tuán)中也發(fā)現(xiàn)Nanog、STAT3表達(dá)量較高[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在食管癌組織中Nanog、STAT3的表達(dá)量高于癌旁組織,這一結(jié)果表明食管癌組織中可能含有高表達(dá)Nanog、STAT3的腫瘤干細(xì)胞,在食管癌的發(fā)生階段發(fā)揮重要作用。

    本研究結(jié)果顯示低分化癌組織中Nanog、STAT3的陽性率明顯高于中高分化的癌組織中,表明食管癌的發(fā)展、分化過程中有Nanog、STAT3的參與,與 Siu報(bào)道結(jié)果相似[13]。而Nanog、STAT3可能位于干細(xì)胞維持全能性及自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂端,協(xié)同作用來調(diào)控與干細(xì)胞自我更新及分化方面有關(guān)的基因[14]。干細(xì)胞的分化狀態(tài)與Nanog、STAT3的表達(dá)水平密切相關(guān)[15],在維持干細(xì)胞的低分化狀態(tài)、維持自我更新潛能及保持全能性方面與Nanog、STAT3的作用也是分不開的。而本研究中食管癌組織中Nanog和STAT3的表達(dá)明顯高于癌旁組織,并且在低分化食管癌組織中的表達(dá)明顯高于高、中分化程度的食管癌。Nanog和STAT3的表達(dá)與臨床病理特征的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否有關(guān)。并且,食管癌癌組織中Nanog和STAT3的表達(dá)呈相關(guān)性,研究結(jié)果表明食管癌發(fā)生與可能與腫瘤干細(xì)胞 Nanog和STAT3的表達(dá)呈相關(guān),有望同前列腺癌中STAT3的作用一樣作為食管癌診斷的分子標(biāo)志。

    總之,本研究結(jié)果提示STAT3、Nanog基因可能在食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮重要作用,可能成為食管癌基因診斷和治療的新靶點(diǎn)。

    [1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global Cancer Statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55:74-108.

    [2]Chambers I,Colby D,Robertson M,et al.Functional expression cloning of Nanog,a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells[J].Cell,2003,113(5):643-655.

    [3]Liu D,Zhou P,Zhang L,et al.HDAC1/DNMT3A-containing complex is associated with suppression of Oct4 in cervical cancer cells[J].Biochemistry(Mosc),2012,77(8):934-940.

    [4]Alshamsan A,Hamdy S,Samuel J,et al.The induction of tumor apoptosis in B16 melanoma following STAT3 siRNA delivery with a lipid-substituted polyethylenimine[J].Biomaterials,2010,31(6):1420-1428.

    [5]Park IH,Zhao R,West JA,et al.Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors[J].Nature 2008,451(7175):141-146.

    [6]Pan G,Thomson JA.Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency[J].Cell Res,2007,17(1):42-49.

    [7]Evans MJ,Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292(5819):154-156.

    [8]Molofsky AV,Pardal R,Morrison SJ.Diverse mechanisms regulate stem cell self-renewal[J].Curr Opin Cell Biol,2004,16(6):700-707.

    [9]Lewitzky M,Yamanaka S.Reprogramming somatic cells towards pluripotency by defined factors[J].Curr Opin Biotechnol,2007,18(5):467-473.

    [10]Ezeh UI,Turek PJ,Reijo RA,et al.Human embryonic stem cell genes Oct4,Nanog,STELLAR,and GDF3 are expressed in both seminoma and breast carcinoma[J].Cancer,2005,104(10): 2255-2265.

    [11]Har AH,Hartley L,Parker k,et al.The pluripotency homeobox gene NANOG is expressed in human germ cell tumors[J].Cancer,2005,104(10):2092-2098.

    [12]Ben-Porath I,Thomson MW,Carey VJ,et al.An embryonic stem cell-like gene expression signature in poorly differentiated aggressive human tumors[J].Nat Genet,2008,40(5):499-507.

    [13]Siu MK,Wong ES,Chan HY,et al.Overexpression of NANOG in gestational trophoblastic diseases effect on apoptosis,cell invasion and clinical outcome[J].Am J Pathol,2008,173(4): 1165-1172.

    [14]Ezeh UI,Turek PJ,Reijo RA,et al.Human embryonic stem cell genes OCT4,NANOG,STELLAR,and GDF3 are expressed in both seminoma and breast carcinoma[J].Cancer,2005,101(10):2255-2265.

    [15]Torres-Roca JF,DeSilvio M,Mora LB,et al.Activated STAT3 as a correlate of distant metastasis in prostate cancer:a secondary analysis of Radiation Therapy Oncology Group 86-10[J].Urology,2007,69(3):505-509.

    [16]Shodeinde AL,Barton BE.Potential use of STAT3 inhibitors in targeted prostate cancer therapy:future prospects[J].Onco Targets Ther,2012,5:119-125.

    Expression of STAT3 and Nanog Gene in Esophageal Cancer and Its Correlation with the Clinicopathological Characteristics

    LU Xiao1,FENG Xiao-shan1,GAO She-gan1,ZHOU Fu-you2,WANG Neng-chao2,YANG Hai-jun2

    (1.First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Anyang Tumor Hospital,Anyang 455000,China)

    ObjectiveTo explore STAT3 and Nanog gene expression in esophageal cancer tissues and its correlation with the clinicopathological characteristic in order to look for new targets of gene therapy for esophageal cancer.MethodsThere were 50 cases of esophageal cancer which was selected from the Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology in 2014 as the research object.The expression of STAT3 and Nanog mRNA was detected by RT-PCR in esophageal carcinoma and paracancerous tissues.Meanwhile the expression and localization of STAT3 and Nanog protein were detected by Western blot technique and immunohistochemical technique in same tissues.ResultsThe mRNA and protein expression of STAT3 and Nanog in esophageal cancer tissues was significantly higher than that in paracancerous tissue(P<0.05).The expression of STAT3 and Nanog in poorly differentiated esophageal cancer tissues was observably higher than that in other differentiated cancer tissues(P<0.05).Among esophageal cancer tissues,without lymph node metastasis cancer tissues were accompanied with significantly lower positive expression rates than the tissues with lymph node metastasis(P<0.05).The esophageal cancer tissues without distant metastasis have less expression of STAT3 and Nanog than the tissues with distant metastasis(P<0.05).The expression of STAT3 and Nanog in Esophageal cancer tissues showed positive correlation(r=0.303,P<0.05).ConclusionSTAT3 and Nanog gene may play an important role in carcinogenesis and development of esophageal cancer,and it might be the new target genes for diagnosis and treatment of esophageal cancer.

    esophagus cancer;STAT3;Nanog;RT-PCR;Western blot; immunohistochemisty

    1672-688X(2016)03-0170-04DOI:10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.03.003

    2016-01-26

    1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南洛陽 471003

    2.安陽市腫瘤醫(yī)院,河南安陽 455000

    陸曉(1986-),男,山東肥城人,醫(yī)師,從事腫瘤科臨床工作。

    馮笑山,男,博士,教授,E-mail:samfeng137@hotmail.com

    R735.1

    A

    猜你喜歡
    精原細(xì)胞免疫組化食管癌
    FGFs/FGFRs及其介導(dǎo)信號(hào)通路基因的異常表達(dá)影響犏牛未分化精原細(xì)胞增殖活性
    枸杞多糖保護(hù)小鼠GC-1spg精原細(xì)胞氧化損傷的研究
    夏枯草水提液對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的治療作用及機(jī)制研究
    嬰幼兒原始黏液樣間葉性腫瘤一例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    結(jié)直腸癌組織中SOX9與RUNX1表達(dá)及其臨床意義
    精原細(xì)胞瘤頸部轉(zhuǎn)移病例1例
    精原細(xì)胞分化及維甲酸在其中的作用與機(jī)制研究進(jìn)展
    miRNAs在食管癌中的研究進(jìn)展
    MCM7和P53在食管癌組織中的表達(dá)及臨床意義
    子宮瘢痕妊娠的病理免疫組化特點(diǎn)分析
    内地一区二区视频在线| 日韩av不卡免费在线播放| 一本精品99久久精品77| 天堂影院成人在线观看| 高清在线视频一区二区三区 | 麻豆成人av视频| 99热这里只有精品一区| 男人狂女人下面高潮的视频| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美成人a在线观看| 一区二区三区免费毛片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 午夜福利视频1000在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 两个人视频免费观看高清| 一区二区三区四区激情视频 | 国产一级毛片在线| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜福利视频1000在线观看| 插阴视频在线观看视频| 亚洲四区av| 男女视频在线观看网站免费| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲国产精品合色在线| 黄片wwwwww| 国产成人91sexporn| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产真实乱freesex| 欧美zozozo另类| 亚洲国产色片| 精品无人区乱码1区二区| 成人二区视频| 天堂影院成人在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 秋霞在线观看毛片| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久久久久久久久丰满| 天堂网av新在线| 成人永久免费在线观看视频| av福利片在线观看| 国产三级中文精品| 精品午夜福利在线看| 免费观看的影片在线观看| 久久人妻av系列| 亚洲中文字幕日韩| 国产av不卡久久| 1024手机看黄色片| 看黄色毛片网站| 日韩av不卡免费在线播放| 国产成人精品婷婷| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品野战在线观看| 国产三级中文精品| 亚洲无线在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 成人无遮挡网站| 看非洲黑人一级黄片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 毛片女人毛片| 色综合亚洲欧美另类图片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 熟女电影av网| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美最黄视频在线播放免费| 午夜免费男女啪啪视频观看| 免费av不卡在线播放| 日本-黄色视频高清免费观看| 成年女人看的毛片在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 久久精品91蜜桃| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| а√天堂www在线а√下载| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 伦理电影大哥的女人| 久久99蜜桃精品久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲成人久久爱视频| 久久这里有精品视频免费| 中文亚洲av片在线观看爽| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲四区av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国内精品美女久久久久久| 少妇丰满av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品日产1卡2卡| 麻豆一二三区av精品| 日韩一本色道免费dvd| 在线免费观看的www视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 久久精品国产清高在天天线| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜精品在线福利| 真实男女啪啪啪动态图| 女同久久另类99精品国产91| 美女黄网站色视频| 久久久久久国产a免费观看| 久久午夜福利片| 国产精品永久免费网站| 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美色视频一区免费| 日本一本二区三区精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品午夜福利在线看| 精品人妻熟女av久视频| 成人欧美大片| 男人舔奶头视频| 国产一区二区激情短视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品久久久久久久久久免费视频| 日韩一本色道免费dvd| 国产私拍福利视频在线观看| 日本欧美国产在线视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 1000部很黄的大片| 精品午夜福利在线看| 久久久国产成人免费| 在线播放国产精品三级| 岛国毛片在线播放| 婷婷六月久久综合丁香| 91久久精品国产一区二区成人| av黄色大香蕉| 九草在线视频观看| 少妇丰满av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲一区高清亚洲精品| 尾随美女入室| 精品久久久久久久久亚洲| 中国国产av一级| 1024手机看黄色片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 悠悠久久av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 毛片女人毛片| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久精品国产亚洲网站| 色5月婷婷丁香| 日日啪夜夜撸| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲精品自拍成人| 久久亚洲国产成人精品v| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲最大成人手机在线| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲精品自拍成人| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 久久亚洲精品不卡| 日韩av不卡免费在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 国产不卡一卡二| 日韩中字成人| 亚洲18禁久久av| 一级毛片电影观看 | 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品人妻少妇| 久久久久久大精品| 亚洲国产精品久久男人天堂| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 能在线免费看毛片的网站| 亚洲av电影不卡..在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 国产成人福利小说| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲18禁久久av| 精品人妻熟女av久视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美bdsm另类| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 黄片wwwwww| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品国内亚洲2022精品成人| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲va在线va天堂va国产| 看片在线看免费视频| 最好的美女福利视频网| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产探花在线观看一区二区| ponron亚洲| 精品久久国产蜜桃| 精品一区二区三区视频在线| 中国美白少妇内射xxxbb| www.色视频.com| 久久韩国三级中文字幕| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美一区二区精品小视频在线| 九色成人免费人妻av| 特大巨黑吊av在线直播| 中文亚洲av片在线观看爽| 男人舔女人下体高潮全视频| 热99re8久久精品国产| 国产午夜精品论理片| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久九九精品影院| 亚洲三级黄色毛片| 2022亚洲国产成人精品| 69人妻影院| 欧美高清性xxxxhd video| 悠悠久久av| 久久久久久伊人网av| 91久久精品国产一区二区成人| 国产视频内射| 国产精品伦人一区二区| 岛国在线免费视频观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产欧美日韩精品一区二区| 色哟哟哟哟哟哟| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲国产精品合色在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 热99re8久久精品国产| 丝袜喷水一区| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 少妇丰满av| 嫩草影院新地址| 人妻少妇偷人精品九色| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久久欧美国产精品| 国产乱人视频| 婷婷色综合大香蕉| 有码 亚洲区| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本黄色片子视频| 午夜久久久久精精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲人成网站高清观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 美女大奶头视频| 国产精品女同一区二区软件| 成人美女网站在线观看视频| 大型黄色视频在线免费观看| 乱人视频在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品女同一区二区软件| 久久久久久久久久久丰满| 国产高清不卡午夜福利| 国产视频首页在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日本欧美国产在线视频| 亚洲色图av天堂| 美女黄网站色视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日本黄大片高清| 色综合站精品国产| 亚洲人成网站高清观看| av免费观看日本| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲最大成人中文| 黑人高潮一二区| 欧美高清性xxxxhd video| 国产高潮美女av| 男女边吃奶边做爰视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| av在线亚洲专区| ponron亚洲| 熟女人妻精品中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 毛片女人毛片| 亚洲四区av| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 少妇丰满av| av卡一久久| 一区二区三区免费毛片| 欧美bdsm另类| 国产极品天堂在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产精品电影一区二区三区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品久久久久久久久亚洲| av卡一久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久久久九九精品二区国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 日本一本二区三区精品| 九九在线视频观看精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产av一区在线观看免费| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 欧美bdsm另类| 国产精品日韩av在线免费观看| ponron亚洲| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久精品国产清高在天天线| 一级毛片久久久久久久久女| 偷拍熟女少妇极品色| 日韩亚洲欧美综合| 观看免费一级毛片| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲美女视频黄频| 免费大片18禁| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久久九九精品二区国产| 少妇的逼好多水| 免费观看人在逋| 欧美丝袜亚洲另类| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 伊人久久精品亚洲午夜| 国内揄拍国产精品人妻在线| 变态另类丝袜制服| 老司机影院成人| 看黄色毛片网站| 大型黄色视频在线免费观看| 国产高清视频在线观看网站| 久久国内精品自在自线图片| 91精品国产九色| 久久久精品大字幕| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 亚洲欧美精品自产自拍| 丰满的人妻完整版| 国产单亲对白刺激| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产av麻豆久久久久久久| 草草在线视频免费看| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久国产网址| 亚洲精品国产成人久久av| 联通29元200g的流量卡| 一边亲一边摸免费视频| 国产精品电影一区二区三区| 欧美一区二区国产精品久久精品| av在线老鸭窝| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | av在线播放精品| 99久久人妻综合| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲最大成人av| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲成人久久性| 91在线精品国自产拍蜜月| 免费观看精品视频网站| 午夜a级毛片| 国产一级毛片在线| 精品久久久久久久久亚洲| 国产v大片淫在线免费观看| 国产一区二区三区av在线 | 国产精品久久久久久精品电影| 内地一区二区视频在线| 久久久久久久久大av| 国产乱人偷精品视频| www.色视频.com| 国产av一区在线观看免费| 久久久成人免费电影| 亚洲久久久久久中文字幕| 热99在线观看视频| 国产 一区 欧美 日韩| 精品一区二区免费观看| 真实男女啪啪啪动态图| 长腿黑丝高跟| 国产欧美日韩精品一区二区| or卡值多少钱| 色5月婷婷丁香| 在线观看美女被高潮喷水网站| 尾随美女入室| 综合色丁香网| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产美女午夜福利| 此物有八面人人有两片| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品综合久久久久久久免费| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 毛片女人毛片| 在线a可以看的网站| 性色avwww在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 中国美白少妇内射xxxbb| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 男女那种视频在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 日本在线视频免费播放| 久久精品国产清高在天天线| 久久久久久久久久久丰满| 草草在线视频免费看| 中出人妻视频一区二区| 波多野结衣高清无吗| 人妻系列 视频| 国产高潮美女av| 最近2019中文字幕mv第一页| 九九在线视频观看精品| 国产淫片久久久久久久久| 在线观看免费视频日本深夜| 久久国内精品自在自线图片| 高清毛片免费看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 干丝袜人妻中文字幕| 国产精品.久久久| 长腿黑丝高跟| 欧美xxxx性猛交bbbb| 麻豆成人av视频| 久久久久久久久久黄片| av女优亚洲男人天堂| 欧美一级a爱片免费观看看| 五月伊人婷婷丁香| 久久午夜亚洲精品久久| 成人欧美大片| 男女下面进入的视频免费午夜| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产在线男女| 亚洲av.av天堂| 美女内射精品一级片tv| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产高清不卡午夜福利| 深爱激情五月婷婷| 色尼玛亚洲综合影院| 日本-黄色视频高清免费观看| 嫩草影院新地址| 可以在线观看毛片的网站| 草草在线视频免费看| 精品日产1卡2卡| 中文欧美无线码| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 免费看日本二区| 久久99蜜桃精品久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 少妇熟女欧美另类| 波多野结衣高清无吗| 国产精品久久久久久久久免| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲国产精品成人久久小说 | 日韩欧美国产在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 久久精品影院6| 午夜老司机福利剧场| 最好的美女福利视频网| 国模一区二区三区四区视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 五月伊人婷婷丁香| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| ponron亚洲| 国产精品嫩草影院av在线观看| 全区人妻精品视频| 在线观看午夜福利视频| 国产成人freesex在线| 国产av不卡久久| 精品久久久久久成人av| 小说图片视频综合网站| АⅤ资源中文在线天堂| 最近手机中文字幕大全| 亚洲欧美日韩东京热| 97超视频在线观看视频| 人妻少妇偷人精品九色| av.在线天堂| 欧美一区二区亚洲| 国产色婷婷99| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产一级毛片在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 校园人妻丝袜中文字幕| 午夜免费激情av| 日韩欧美在线乱码| 色综合亚洲欧美另类图片| 中文字幕制服av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 欧美色视频一区免费| 女同久久另类99精品国产91| 一级二级三级毛片免费看| 一级av片app| 成人毛片60女人毛片免费| 乱人视频在线观看| 免费看日本二区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日韩高清综合在线| 亚洲av熟女| 国产乱人偷精品视频| 婷婷亚洲欧美| 九九热线精品视视频播放| 别揉我奶头 嗯啊视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产私拍福利视频在线观看| 国产成人影院久久av| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲欧美清纯卡通| 网址你懂的国产日韩在线| 色哟哟·www| 国产乱人偷精品视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 在现免费观看毛片| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产高清有码在线观看视频| 麻豆一二三区av精品| 国产成人福利小说| 少妇高潮的动态图| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜爱爱视频在线播放| 久久精品国产自在天天线| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩一区二区视频免费看| 两个人视频免费观看高清| 久久久久久久久久成人| 国内精品宾馆在线| 国产老妇女一区| 一进一出抽搐动态| 一区二区三区高清视频在线| 中文字幕制服av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲自偷自拍三级| 联通29元200g的流量卡| 麻豆国产97在线/欧美| 少妇高潮的动态图| 亚洲高清免费不卡视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久国产成人精品二区| 99热只有精品国产| 99热这里只有是精品50| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 18禁在线播放成人免费| 麻豆成人av视频| 亚洲最大成人手机在线| 国产高潮美女av| 成年av动漫网址| 美女黄网站色视频| 亚洲在久久综合| 日本爱情动作片www.在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| а√天堂www在线а√下载| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久99精品国语久久久| 成人三级黄色视频| 亚洲真实伦在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 99视频精品全部免费 在线| 超碰av人人做人人爽久久| 国产v大片淫在线免费观看| av.在线天堂| 久久6这里有精品| 亚洲av成人精品一区久久| 色哟哟哟哟哟哟| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 免费av毛片视频| 人妻系列 视频| 黄片wwwwww| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 韩国av在线不卡| 又粗又爽又猛毛片免费看| 日本黄色片子视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国国产精品蜜臀av免费| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 丰满人妻一区二区三区视频av| 99久国产av精品| 免费av毛片视频| 内地一区二区视频在线| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 91久久精品国产一区二区成人| 婷婷精品国产亚洲av| 一夜夜www| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久久网色| av国产免费在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久韩国三级中文字幕| 日韩人妻高清精品专区| 嘟嘟电影网在线观看| 国产一区二区激情短视频| 网址你懂的国产日韩在线| 国产老妇伦熟女老妇高清| 2021天堂中文幕一二区在线观| 麻豆国产av国片精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久久久免费精品人妻一区二区| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美潮喷喷水| 亚洲自偷自拍三级| 国产色爽女视频免费观看| 91av网一区二区| 国产日本99.免费观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 婷婷色av中文字幕| 日产精品乱码卡一卡2卡三|