酶促合成二氫楊梅素酯化物及其純化的研究

吳　歡， 李　衛(wèi)， 郭　巍， 陳愛洋， 朱　林， 萬端極

(1湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068; 湖北 武漢 430068; 2湖北工業(yè)大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

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酶促合成二氫楊梅素酯化物及其純化的研究

吳歡1， 李衛(wèi)2， 郭巍1， 陳愛洋1， 朱林1， 萬端極1

(1湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068; 湖北 武漢 430068; 2湖北工業(yè)大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

采用雪白根霉脂肪酶催化二氫楊梅素和乙酸乙烯酯合成二氫楊梅素單酯化物，探索不同溶劑作為酶促酯化的反應(yīng)體系，確定最佳的反應(yīng)體系為：以乙腈為溶劑，雪白根霉脂肪酶的量為500 U，乙酸乙烯酯與二氫楊梅素的物質(zhì)的量之比為15～20，溫度45℃，時間24～36 h。二氫楊梅素轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)83.6%，利用薄層層析法分離出二氫楊梅素單酯化物的條件：V(氯仿)∶V(丙酮)∶V(乙酸)=60∶38∶2，二氫楊梅素單酯化物的純度可達(dá)96%。

二氫楊梅素； 脂肪酶； 酯化反應(yīng)； 轉(zhuǎn)化率

二氫楊梅素占藤茶莖葉干重的30%以上，是藤茶的主要活性物質(zhì)[1]，其特殊結(jié)構(gòu)決定它具有一定的親水性，而油溶性較差，導(dǎo)致其抗氧化活性和抑菌性等作用在多種應(yīng)用方面受到限制[2]。研究表明，選擇合適的?；瘎Χ錀蠲匪剡M(jìn)行酯化反應(yīng)，可解決其難溶于油的問題，其抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等活性也會有所增強[3]。

本研究首次將雪白根霉脂肪酶作為催化劑，研究乙腈、丙酮、四氫呋喃、叔丁醇、二甲基亞砜等作為溶劑，以及底物摩爾比、溫度、酶量和時間等不同因素對反應(yīng)的影響，將二氫楊梅素轉(zhuǎn)化率和初始轉(zhuǎn)化率作為考察指標(biāo)，選取最佳反應(yīng)條件?？疾楸訉游龇ǚ蛛x出二氫楊梅素單酯化物的條件，為二氫楊梅素酯化物的工業(yè)化酶催化合成二氫楊梅素酯化物的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　實驗部分

1.1實驗材料與主要儀器

主要原料和試劑：二氫楊梅素，純度98%；甲醇，色譜純；乙酸乙烯酯，分析純；乙腈，分析純；丙酮，分析純；四氫呋喃，分析純；叔丁醇，分析純；二甲基亞砜，分析純；冰乙酸，分析純。

主要儀器和設(shè)備：恒溫空氣浴搖床TS-211B，北京天翔儀器設(shè)備有限公司；臺式高速離心機TLL-C，上海精密儀器儀表公司；真空干燥箱DZF-6050，北京興爭儀器設(shè)備廠；高效液相色譜儀UltiMate3000，上海禾木儀器有限公司；Nexus-870傅立葉變換紅外光譜儀，海雪弘儀器有限公司；安捷倫6240質(zhì)譜-1200液相，上海雪弘儀器有限公司。

1.2二氫楊梅素酯化物合成方法

在10 mL帶塞三角瓶中各加入2 mL溶劑，加入一定量的乙酸乙烯酯和二氫楊梅素，在合適溫度和轉(zhuǎn)速的條件下，反應(yīng)一定時間，取樣，用甲醇水溶液稀釋至100倍，離心(15 000 r/min)15 min后，取上清液(20 μL)，供高效液相色譜分析。

高效液相色譜的檢測方法：流動相A為乙腈，流動相B為0.1%的乙酸水溶液；梯度洗脫程序：0～8 min，28%～30%乙腈；8～15 min，30%～80%乙腈；15～25 min，80%～28%乙腈(體積比)；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

二氫楊梅素轉(zhuǎn)化率的計算：根據(jù)二氫楊梅素峰面積的減少量與反應(yīng)前二氫楊梅素峰面積比值。

反應(yīng)初速度：根據(jù)反應(yīng)初始階段單位時間內(nèi)底物的峰面積減少量來計算初始反應(yīng)速度。

1.3二氫楊梅素酯化物的分離純化方法

將大小合適的玻璃板用乙醇和丙酮洗凈搽干。取適量薄層色譜用的硅膠用蒸餾水調(diào)成糊，用杵碾磨0.5 h后，將碾磨好的糊狀物涂抹在玻璃板上，振動使糊狀物在玻璃板上攤平，晾干。使用前放入105～115℃烘箱進(jìn)行活化40～50 min后，冷卻后使用。取少量的丙酮將樣品溶解，在距薄層板底邊1～2 cm畫好基線，用毛細(xì)管蘸取溶解好的樣品液，在薄層板基線上點樣，根據(jù)實際情況可多次點樣，樣點直徑在1～1.5 mm之間，將薄層板垂直放入盛有展開劑(V(氯仿) ∶V(丙酮) ∶V(乙酸)=60∶38 ∶2)的有蓋展開瓶中，蓋上瓶蓋。待目標(biāo)物上升到合適高度，取出薄層板，在紫外燈下顯色或用10%FeCl3使其顯色。計算各組分的相對移動值。

1.4二氫楊梅素酯化物的分子鑒定

1.4.1紅外圖譜分析FT-IR檢測：在瑪瑙研缽中加入1～2 mg取純化后的產(chǎn)物進(jìn)行研細(xì)，后在研缽加入約100～200 mg溴化鉀粉末，一起研磨至2 μm以下且混合均勻，轉(zhuǎn)移至模具中，按順序放好各部件后，置于壓片機中抽真空5 min，然后邊抽氣邊加壓，當(dāng)壓力達(dá)到68.6 MPa時，停止加壓，維持5 min后，解壓，當(dāng)壓力表指針為“0”，取出模具，即得透明的晶片。以空氣為對照，用紅外光譜儀分析。

1.4.2質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析條件：將純化后的產(chǎn)物用乙腈溶解，二氫楊梅素作為對照組，分別配置濃度為2μmol/L的溶液，采用電噴霧電離源(ESI)正離子模式檢測，電噴霧電壓為3.0 kV；電噴霧接口干燥氣(NZ)流速為3 181 L/h，脫溶劑溫度為250℃；碰撞誘導(dǎo)解離電壓為30 V；離子源溫度為120℃。

2　結(jié)果與討論

2.1溶劑的影響

在5個10 mL帶塞三角瓶中各加入2 mL溶劑(乙腈、丙酮、四氫呋喃、叔丁醇、二甲基亞砜)、20 mmol/L二氫楊梅素、500 mmol/L乙酸乙烯酯(VA)和500 U雪白根霉脂肪酶，混合均勻，搖床設(shè)定溫度為40℃、轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)24 h，取樣分析。結(jié)果見表1。

一般認(rèn)為，酶在疏水性溶劑中的催化活性比在親水性溶劑中高，因此酶反應(yīng)在非極性溶劑中更易進(jìn)行。但對于疏水性較強的有機溶劑，由于疏水底物的溶劑化使底物不易從溶劑中擴散到酶分子周圍，酶活力就降低[4]。可見疏水性對反應(yīng)的影響是多方面的。對于本研究而言，選擇溶劑時必須充分考慮底物在不同溶劑中的溶解特性。

表1結(jié)果表明，二氫楊梅素在乙腈中的溶解度最低，然而，二氫楊梅素的轉(zhuǎn)化率最高，在叔丁醇中的轉(zhuǎn)化率最低。在這幾種有機溶劑中，溶劑疏水常數(shù)和二氫楊梅素在溶劑中的溶解度與酯化反應(yīng)沒有相關(guān)性。

表1　二氫楊梅素(DMY)在不同有機溶劑中的轉(zhuǎn)化率及其它參數(shù)

2.2底物摩爾比對酶促酯化反應(yīng)的影響

在6個10 mL帶塞三角瓶中分別加入2 mL乙腈，20 mmol/L二氫楊梅素、不同摩爾濃度的乙酸乙烯酯(乙酸乙烯酯與二氫楊梅素的物質(zhì)的量之比為：3、7、10、15、20、25)和500 U雪白根霉脂肪酶，混合均勻，搖床設(shè)定溫度為40℃、轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)36 h，取樣分析。結(jié)果見圖1。

圖 1　底物物質(zhì)的量之比對酶促酯化反應(yīng)的影響

由圖1可知，當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量之比低于10時，隨著該比值的提高，反應(yīng)的初速度和底物轉(zhuǎn)化率均迅速提高；當(dāng)物質(zhì)的量之比超過10時，隨著該比值的升高，反應(yīng)初速度和相同時間內(nèi)的底物轉(zhuǎn)化率仍呈增加的趨勢，但增加的幅度開始趨于緩和；當(dāng)?shù)孜镂镔|(zhì)的量之比高于20時，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率增加較緩慢，初速度趨于平穩(wěn)，此時，底物物質(zhì)的量之比對反應(yīng)初速度和底物轉(zhuǎn)化率的影響較小。綜合考慮，認(rèn)為酶促二氫楊梅素乙酯化反應(yīng)的最適底物物質(zhì)的量之比為15～20。脂肪酶催化二氫楊梅素與乙酸乙烯酯的酯化反應(yīng)屬于雙底物反應(yīng)，在所研究的濃度范圍內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)乙酸乙烯酯或二氫楊梅素對雪白根霉脂肪酶有明顯的抑制作用。

2.3反應(yīng)溫度對酶促酯化反應(yīng)的影響

在5個10 mL帶塞三角瓶中分別加入2 mL含20 mmol/L二氫楊梅素、500 mmol/L乙酸乙烯酯的乙腈溶液，加入500 U雪白根霉脂肪酶，混合均勻，分別設(shè)置搖床的溫度為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，振蕩速率都設(shè)置為200 r/min，反應(yīng)36 h后取反應(yīng)液分析。結(jié)果見圖2。

圖 2　反應(yīng)溫度對酶促酯化反應(yīng)的影響

為了揭示溫度對有機溶劑中酶促催化二氫楊梅素定位選擇性酯化反應(yīng)的影響規(guī)律，對比研究30～50℃范圍內(nèi)的酶促二氫楊梅素與乙酸乙烯酯的酯化反應(yīng)。由圖2可知，在30～45℃內(nèi)，酶促二氫楊梅素乙酯化反應(yīng)的初速度隨之增大，這或可歸因于：1)底物的溶解度增大；2)酶分子與底物分子之間在單位時間內(nèi)有效碰撞增多，結(jié)合速度加快；3)反應(yīng)介質(zhì)的粘度下降，使傳質(zhì)阻力減小[5]等。當(dāng)溫度高于45℃時，再提高溫度對反應(yīng)影響不大。

2.4酶量對酶促酯化反應(yīng)的影響

在6個10 mL帶塞三角瓶中分別加入2 mL乙腈、20 mmol/L二氫楊梅素、500 mmol/L乙酸乙烯酯和不同量的雪白根霉脂肪酶(50 U、100 U、250 U、500 U、750 U、1000 U)，混合均勻，搖床設(shè)定溫度為40℃、轉(zhuǎn)速200 r/min，反應(yīng)36 h后取樣分析。結(jié)果見圖3。

在有機溶劑中，脂肪酶的加入量對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率有很大影響。酶能通過瞬時地與反應(yīng)物結(jié)合成過渡態(tài)從而降低反應(yīng)所需的活化能[6]，增加活化分子的數(shù)量，使反應(yīng)的速率提高，在較短的時間內(nèi)達(dá)到化學(xué)平衡，使轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值。

圖 3　酶量對酯化反應(yīng)的影響

圖3表明，當(dāng)酶量低于500 U時，反應(yīng)速度的增加趨近于線性增長，說明雪白根霉脂肪酶對二氫楊梅素的酯化反應(yīng)的催化效率較高，當(dāng)繼續(xù)增大酶量超過500 U時，反應(yīng)速度增長趨緩慢，轉(zhuǎn)化率趨于最大值，由于平衡不移動，故轉(zhuǎn)化率增加不明顯。綜合考慮反應(yīng)速度、底物轉(zhuǎn)化率和成本等因素，酶量以500 U為宜。

2.5反應(yīng)時間酶促酯化反應(yīng)的影響

在6個10 mL帶塞三角瓶中分別加入2 mL含20 mmol/L二氫楊梅素、500 mmol/L乙酸乙烯酯的乙腈溶液，加入500 U雪白根霉脂肪酶，混合均勻，搖床設(shè)定溫度為40℃、轉(zhuǎn)速200 r/min，取反應(yīng)時間分別為1 h、5 h、9 h、12 h、24 h、48 h的反應(yīng)液50 μL，供高效液相色譜分析。結(jié)果見圖4。

反應(yīng)的時間達(dá)到臨界時，合成量趨于平衡，延長時間對反應(yīng)的影響不大，由于酶被飽和達(dá)到了最大催化力；另一方面是由于底物的積累出現(xiàn)逆反應(yīng)的發(fā)生[7]，因此，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到一定時間后，隨著時間的增加，合成量漸漸趨于穩(wěn)定。

圖 4　反應(yīng)時間對酯化反應(yīng)的影響

由圖4可知，反應(yīng)24 h以前，二氫楊梅素轉(zhuǎn)化率迅速增長。當(dāng)反應(yīng)超過24 h后，延長反應(yīng)時間對于二氫楊梅素轉(zhuǎn)化率幾乎沒有影響，酯化反應(yīng)存在逆反應(yīng)，而長時間進(jìn)行反應(yīng)，生成的酯化物會被催化水解而使產(chǎn)物分解[8-10]。因此，考慮轉(zhuǎn)化率和能耗，反應(yīng)時間控制在24～36 h較好。

2.6二氫楊梅素酯化物的分離純化

薄層層析能夠快速分離樣品，根據(jù)各組分性質(zhì)不同，展開的距離也不同[9]，二氫楊梅素酯化物薄層斑點照片見圖5，二氫楊梅素及其單酯和多酯的Rf值分別是0.320、0.604和0.792。

圖 5　酯化粗產(chǎn)物的薄層層析圖

2.7二氫楊梅素酯化物結(jié)構(gòu)分析

2.7.1紅外分析從圖6可以看出，二氫楊梅素在3200～3600 cm-1處有一個較寬的峰，這是羥基特征吸收峰，由于羥基之間強烈的氫鍵作用，所以峰形較寬[11]。在1739 cm-1處有較明顯羰基的特征吸收峰，紅外光譜對照圖充分證明二氫楊梅素經(jīng)過了酰化反應(yīng)產(chǎn)生酯化物。

(a)DMY紅外圖譜

(b)DMY酯化物紅外圖譜圖 6　DMY及其酯化物的紅外圖譜

2.7.2質(zhì)譜分析采用電噴霧電離法(ESI)的液質(zhì)聯(lián)用分析近年來應(yīng)用頗多。該方法靈敏度和可靠性更高,且較之傳統(tǒng)的紅外光譜更為簡便，不需對照品或標(biāo)準(zhǔn)樣品就可對復(fù)雜化合物成分進(jìn)行分析。已知二氫楊梅素的分子量為320，從質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以看出，二氫楊梅素質(zhì)譜圖中顯示分子量為320，另一個圖譜顯示峰分子量為363，應(yīng)該是二氫楊梅素單乙酸酯。

圖 7　二氫楊梅素質(zhì)譜圖

圖 8　二氫楊梅素單酯化物質(zhì)譜圖

3　結(jié)論

1)選擇合適的酰化劑，不影響二氫楊梅素的抗氧化活性，使之具備更好的脂溶性是一個非常值得研究的課題。本實驗選取雪白根霉脂肪酶作為催化劑在一定的條件下，酶量為500 U，底物物質(zhì)的量之比為1∶20，反應(yīng)溫度為45℃，反應(yīng)時間控制在36 h。二氫楊梅素的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)83.6%。脂肪酶催化具有較高的區(qū)域選擇性特點，其催化轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通的化學(xué)催化法，使用后的脂肪酶,進(jìn)行活化后可重復(fù)利用多次,仍具有一定的催化效果。

2)可將長鏈脂肪酸特別是具有保健功效的長鏈不飽和脂肪酸引入到二氫楊梅素分子上，通過選擇適當(dāng)?shù)孽；瘎?、溶劑系統(tǒng)及脂肪酶以獲得更理想的酯化產(chǎn)物。

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[責(zé)任編校： 張眾]

The Purification and Synthesis of Dihydromyricetin Esters by Lipase

WU Huan1, LI Wei2, GUO Wei1, CHEN Aiyang1, ZHU Lin1

(1SchoolofResourcesandEnvironmentalEngin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China; 2SchoolofFoodandPharmaceuticalEngin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Dihydromyricetin esters is achieved with dihydromyricetin and vinyl acetate by lipase catalyzed synthesis. The best system for the enzymatic esterification reaction is explored by different solvents. The best system is determined: Acetonitrile as a solvent. The appropriate amount of Lipase is RN 500U. The optimum substrate molar ratio (Dihydromyricetin: vinyl acetate) 1:15 ～ 1:20. Optimum reaction temperature is 45℃. The reaction time is better controlled in 24 36h. Under the optimal reaction conditions, Dihydromyricetin conversion rate could reach 83.6%. The separation condition was investigated. The results show that chloroform: acetone: acetic acid = 60: 38: 2(by volume).The purity of dihydromyricetin esters can reach up to 96%.

dihydromyricetin；lipase RN；esterification；conversion rate

2016-04-11

“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD33B03)；湖北省自然科學(xué)基金項目(2008CDZ001)；湖北工業(yè)大學(xué)高層次人才啟動基金項目(BSQD0814)

吳歡(1990-)， 女，湖北黃岡人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物的提取分離純化

萬端極(1953-)，男，湖北枝江人，湖北工業(yè)大學(xué)教授，研究方向為膜技術(shù)應(yīng)用，清潔生產(chǎn)工藝，天然產(chǎn)物提取與分離純化

1003-4684(2016)04-0089-04

TS21

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