一株神舟十號飛船分離少動鞘氨醇單胞菌基因組測序結果及分析

徐 綢，謝 瓊，辛冰牧，劉長庭*

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京100853；2.中國航天員科研訓練中心，北京100094）

一株神舟十號飛船分離少動鞘氨醇單胞菌基因組測序結果及分析

徐 綢1，謝 瓊2，辛冰牧2，劉長庭1*

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京100853；2.中國航天員科研訓練中心，北京100094）

在神舟十號飛船中檢測出一株下行菌，16 S rDNA鑒定后命名為少動鞘氨醇單胞菌LCTSP1。通過對該菌基因組進行二代測序及基因注釋，發(fā)現(xiàn)該菌包含3884個蛋白編碼基因、3個rRNA編碼基因和47個tRNA編碼基因。通過對該菌基因組進行COG、GO分析及注釋，完善了該菌的遺傳信息，并建立了該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。分析發(fā)現(xiàn)該菌包含腐蝕相關基因并可適應惡劣的生存環(huán)境。通過基因注釋發(fā)現(xiàn)該菌包含574個毒力相關基因以及57個耐藥相關基因，提示該菌存在潛在的致病性。

少動鞘氨醇單胞菌；基因測序；腐蝕性；致病性

1　引言

少動鞘氨醇單胞菌原名少動假單胞菌，廣泛存在于水、土壤等自然環(huán)境中［1］，是一種嚴格需氧的革蘭氏陰性非發(fā)酵鞘氨醇單胞菌［2］，其氧化酶、過氧化氫酶試驗陽性［3］。少動鞘氨醇單胞菌為條件致病菌，也是鞘氨醇單胞菌屬中唯一具有重要臨床意義的一個種。雖然臨床少動鞘氨醇感染病例較少，但近年來發(fā)病有增加的趨勢，并可導致嚴重的院內感染甚至爆發(fā)感染［4-5］。已有研究證實鞘氨醇單胞菌屬可分解阿魏酸［6］、木質素［7］、聯(lián)苯［8］等材料，我們同期研究發(fā)現(xiàn)該株菌還可以分解環(huán)氧樹脂、酯聚氨酯和醚聚氨酯等多種材料。本研究主要通過對該株少動鞘氨醇單胞菌進行基因組測序及基因組注釋，為發(fā)現(xiàn)該菌的腐蝕機理提供線索，也為該菌致病性研究及臨床防治提供一定依據(jù)。

2　材料與方法

2.1 菌種采集

神舟十號飛船于2013年6月11日17時38分發(fā)射，2013年6月26日8時07分返回，在軌15天，其中12天與天宮一號組成組合體在太空中飛行。返回后在冷凝水樣品中檢測分離出一株微生物，通過16S rDNA鑒定、檢索文獻完善該菌菌種信息，確定為少動鞘氨醇單胞菌［9］，命名為LCT-SP1。

2.2 細菌培養(yǎng)和DNA提取

35℃，LB培養(yǎng)基隔夜培養(yǎng)，然后接種于LB瓊脂糖培養(yǎng)基。按照Illumina公司試劑盒說明書，用CTAB法提取基因組DNA［10］。

2.3 基因組測序和組裝

在上海美吉公司采用Illumina HiSeq2000測序技術對DNA進行paired-end（PE）測序，構建300bp文庫。剪切掉原始數(shù)據(jù)中質量較低的數(shù)據(jù)以利于后續(xù)組裝。利用SOAPdenovo（版本號v1.05）拼接軟件對優(yōu)化序列進行多個Kmer參數(shù)的拼接，得到最優(yōu)的組裝結果。運用GapCloser軟件對組裝結果進行局部內洞填充和堿基校正。依據(jù)拼接序列的總長、scaffold的數(shù)量以及scaffold N50等技術指標，對多個Kmer的組裝結果進行綜合評定，選擇K-mer為31的結果作為最終的組裝結果。

2.4 基因預測和功能注釋

利用RNAmmer和tRNAscan-SE軟件對基因組中包含的rRNA和tRNA進行預測［11-12］。利用Glimmer 3.0軟件進行基因預測［13］。將預測基因的蛋白序列與string數(shù)據(jù)庫（版本號v8.3）進行blastp比對，獲得基因所對應的同源蛋白簇（Clusters of Orthologous Groups of proteins，COG）注釋結果，并根據(jù)COG注釋結果對蛋白進行功能歸類［14］。通過blast2go軟件對blast結果進行基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋分析。自動基因注釋是由NCBI原核基因組注釋自動路徑（PGAAP）完成。用MEGA 5采用NJ（Neighborjoining）法對16S rDNA構建系統(tǒng)發(fā)育樹［15］。

3　結果

3.1 菌株信息

LCT-SP1鑒定為一株少動鞘氨醇單胞菌（變形菌門，α變形菌綱，鞘脂單胞菌目，鞘脂單胞菌科，鞘脂單胞菌屬）。該菌為需氧，非發(fā)酵革蘭氏陰性短桿菌，無孢子生成，活動緩慢。pH 7.2，35℃，低鹽環(huán)境（0-1%氯化鈉）為該菌最適生長條件。該菌可以利用包括葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、醋酸、蘋果酸、Tween-40等碳源。在有氧條件下，該菌在LB培養(yǎng)基中呈現(xiàn)為邊緣整齊的微小黃色菌落。

3.2 基因組結果

3.2.1 基因組測序、組裝及預測結果

表1　LCT-SP1的基因組測序及組裝結果Table 1 Genome sequence and assembly results of LCTSP1

該株LCT-SP1少動鞘氨醇單胞菌的基因組測序及組裝結果如表1所示。該株LCT-SP1染色體包含4 302 226 bp，其中GC含量為65.66%；基因編碼區(qū)包含3 772 440 bp，占基因組87.7%，基因編碼區(qū)基因區(qū)GC含量66.2%，平均每個基因大小為958 bp。編碼區(qū)包含3884個蛋白編碼基因，占3934個總預測基因數(shù)的98.73%。測序共發(fā)現(xiàn)3個rRNA編碼基因和47個tRNA編碼基因。根據(jù)參考基因組使用mavue對細菌草圖con-tig進行排序，再采用genomeviz繪制圈圖（圖1）。該菌的基因組序列已經在GenBank基因庫中提交，檢索號是KR080483。

3.2.2 COG、GO注釋及功能歸類

該菌COG注釋及功能歸類顯示，1906個編碼蛋白被歸類為25個COG中的21個，占總預測基因數(shù)的48.45%。在21個同源蛋白簇中，通用功能（211個）比例最高，其他依次為氨基酸轉錄和代謝（171個），翻譯、核糖體結構和生物轉化（141個），能量生成和轉換（140個），復制、重組和修復（130個），功能未知（124個），轉錄（115個），無機離子運輸和代謝（115個）以及碳水化合物的運輸和代謝（109個）等（圖2）。該菌的基因產物GO注釋及功能歸類如圖3所示。

3.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

對該株LCT-SP1少動鞘氨醇單胞菌進行16 S rDNA鑒定并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)其同土壤和水中分離的haloaromaticamans單胞菌同源性較為接近（圖4）。

圖1　LCT-SP1少動鞘氨醇單胞菌基因組圈圖（從外到里分別是cds、t/rRNA、GC含量和GC skew）Fig.1 Circular map of the draft genome of strain LCT-SP1（From outside to the center：cds，t/rRNA genes，GC content，GC skew）

圖2　LCT-SP1的COG功能歸類圖Fig.2 Number of unigenes associated with the COG functional categories

圖3　LCT-SP1的GO功能歸類圖Fig.3 Number of unigenes associated with the GO functional categories

圖4　LCT-SP1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of LCT-SP1

4　討論

少動鞘氨醇單胞菌可導致社區(qū)感染和醫(yī)院獲得性感染，多發(fā)生于免疫力低下、體內植入物或抗生素治療后患者［16］。曾在腹腔感染、腿部潰瘍、尿路感染、甚至腦膿腫、脾膿腫等標本中檢出。通過基因組分析，發(fā)現(xiàn)該菌不含有編碼脂多糖的相關基因，印證該菌缺乏這一常見的革蘭氏陰性菌重要致病因子，內毒素活性低或許預示該菌較好的預后［17］。但是該菌含有574個毒力相關基因以及57個耐藥相關基因（如編碼青霉素結合蛋白、多藥耐藥外排泵、β-內酰胺酶等基因），提示了該菌潛在的致病性及耐藥性。航天員在軌過程中受微重力等影響，免疫力下降，增加了該菌的致病風險。目前針對該菌基礎研究、臨床研究以及流行病調查較少，其致病機理尚不清晰，對航天員健康存在威脅。

通過基因組測序發(fā)現(xiàn)該菌同可耐受惡劣環(huán)境（高紫外線、高礦化度、高pH值、干燥和極端的溫差）的少動鞘氨醇單胞菌S17的基因高度相符［18］，提示該菌具有頑強的生命力，也預示嚴峻的滅菌難題。LCT-SP1同樣具有編碼NhaA（具有Na+/H+逆向轉運功能）及多亞基陽離子逆向轉運體的基因，說明該菌可以適應堿性及高鹽環(huán)境，并可通過改變pH值造成材料的腐蝕［19］。該菌頑強的生存能力以及對有機材料較強的腐蝕、分解特性，如運用于環(huán)境工程或可有治理污染的廣大前景。

5　結論

1）少動鞘氨醇單胞菌LCT-SP1包含腐蝕相關基因并可適應惡劣的生存環(huán)境。

2）少動鞘氨醇單胞菌LCT-SP1包含574個毒力相關基因以及57個耐藥相關基因，存在潛在的致病性。

（References）

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Genome Sequence Analysis of a Sphingomonas paucimobilis Strain from Shenzhou-10 Spacecraft

XU Chou1，XIE Qiong2，XIN Bingmu2，LIU Changting1*
（1.Nanlou Respiratory Disease Department，the 301th Hospital，Beijing 100853，China；2.China Astronaut Research and Training Center，Beijing 100094，China）

A strain of bacterium，LCT-SP1，was isolated from Shenzhou-10 spacecraft，and identified as Sphingomonas paucimobilis by 16S rDNA sequencing.Its genomic sequence was obtained by the Illumina sequencing platform.After the annotation，3884 protein-coding genes，3 rRNA genes and 47 tRNA genes were found.Based on the COG and GO analysis，the gene-information of the bacteria was obtained.A phylogenetic tree of this bacterium was constructed.The genome analysis shows that the bacterium has corrosion-related genes that might promote its adaptation to the harsh environment.574 virulence associated genes and 57 antibiotic-resistant genes were also found in the genome，which indicated the potential pathogenicity of the bacterium.

Sphingomonas paucimobilis；gene sequence；corrosion；pathogenesis

R856

A

1674-5825（2016）05-0651-04

2015-12-02；

2016-08-13

載人航天預先研究項目（040203）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃資助（973計劃）（2014CB744400）；全軍醫(yī)學科研“十二五”課題重點項目（BWS12J046）；科技部重大專項項目（空間新藥重大創(chuàng)制）（2015ZX09J15102-002）

徐綢（1981-），男，博士，主治醫(yī)師，研究方向為肺部感染和空間醫(yī)學。E-mail：xuchou_1018@163.com

劉長庭（1954-），男，碩士，教授，研究方向為空間生命科學。E-mail：changtingliu@sohu.com