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    丙型肝炎病毒核心抗原酶標抗體的制備及ELISA檢測方法的建立

    2016-10-19 07:42:39譚柏清
    山東工業(yè)技術 2016年19期
    關鍵詞:丙型肝炎抗原特異性

    劉 旭,譚柏清,王 進

    (1.山東恒信檢測技術開發(fā)中心;2.山東博科生物產業(yè)有限公司,濟南 250200)

    丙型肝炎病毒核心抗原酶標抗體的制備及ELISA檢測方法的建立

    劉 旭1,譚柏清2,王 進2

    (1.山東恒信檢測技術開發(fā)中心;2.山東博科生物產業(yè)有限公司,濟南 250200)

    將抗丙型肝炎病毒核心抗原抗體(Anti-HCV Core protein)應用過碘酸鈉法標記辣根過氧化物酶(HRP),制備抗丙型肝炎病毒核心抗原酶標抗體,根據(jù)酶聯(lián)免疫操作步驟,應用美國Ortho公司試劑盒的其它組分,建立一種丙型肝炎病毒核心抗原雙抗夾心檢測法,并對比市場上的試劑盒進行檢測。

    丙型肝炎病毒核心抗原;辣根過氧化物酶;標記;臨床

    0 引言

    丙型病毒性肝炎,簡稱為丙型肝炎、丙肝,是一種由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎,主要經輸血、針刺、吸毒等傳播。

    本實驗通過用辣根過氧化物酶(HRP),對抗丙肝核心抗原抗體進行標記,利用美國ortho公司成品試劑盒的其他組分,組裝形成丙型肝炎核心抗原檢測試劑盒,驗證自制試劑盒的準確性、特異性以及與ortho公司產品的相關性。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    (1)實驗試劑。辣根過氧化物酶(sigma);過碘酸鈉(百靈威科技有限公司);抗HCV-cΑg單克隆抗體(美國賽萊克斯cellex公司);丙型肝炎核心抗原檢測試劑盒(美國0rtho公司);0.2mol/L,pH5.6醋酸鹽緩沖液;0.01mol/L,pH7.4 磷酸鹽緩沖液;1.0mol/L, pH9.5 碳酸鹽緩沖液。(2)主要儀器。BIOBΑSE8001全自動酶免工作站,山東博科生物產業(yè)有限公司;BIOBΑSE洗板機,山東博科生物產業(yè)有限公司;DHP-260恒溫培養(yǎng)箱,常州中捷實驗儀器制造有限公司;微孔板恒溫振蕩器,上海島韓實業(yè)有限公司;高速冷凍離心機,中科中佳 HC-3018R。

    1.2 實驗方法

    (1)試劑盒的應用及檢測實際操作。(2)樣品排布。利用自產的試劑盒與美國ortho公司的對照,檢測臨床42個樣本,對陰陽性符合率進行驗證。每個樣本先用ortho公司的檢測。(3)試劑盒的特異性。選取臨床上的病理樣本,分別為27例類風濕因子(RF)陽性樣本,25例免疫球蛋白陽性樣本,18例自身抗體陽性樣本(上述樣本抗HCV和HCV均為陰性),用自配制的酶標抗體和ortho公司的酶標抗體各檢測一次,驗證試劑盒的特異性。(4)相關性。選擇臨床上丙型肝炎病毒核心抗原強陽性樣本,對該樣本進行等比稀釋。

    分別利用自制試劑盒與Ortho試劑盒對每個樣本重復進行兩次檢測,獲得其吸光強度,比對兩個試劑盒的相關性。

    2 結果與分析

    (1) 試劑盒準確度分析。通過對42個樣本進行檢測,其96孔板顯色程度所示。通過樣本檢測顯色結果顯示,美國ortho公司的試劑盒顯色強度要比自制試劑顯色強度要高,但是陰陽性檢測結果是完全一致的,即該42個樣本中,有8個陽性樣本,兩試劑盒檢測均為陽性,其他樣本兩試劑盒檢測均為陰性,陰陽性符合率為100%。通過該檢測結果,自制的酶標抗體,結合美國ortho公司其他試劑盒組分,組成的自制丙型肝炎病毒核心抗原檢測試劑盒與對照試劑盒準確度一致,顯色強度低說明酶標抗體的濃度與對照試劑盒相比偏低,但是對試劑盒檢測沒有影響,而且還可以節(jié)省試劑盒成本。

    (2)試劑盒特異性分析。利用兩個試劑盒對27例類風濕因子(RF)陽性樣本,25例免疫球蛋白陽性樣本,18例自身抗體陽性樣本(上述樣本抗HCV和HCV均為陰性),進行檢測結果如表1所示。通過以上對于70例病理陽性樣本的檢測,自制丙型肝炎病毒核心抗原檢測試劑盒的特異性較美國ortho公司的成品試劑盒有微弱差異,25例免疫球蛋白陽性樣本中,自產試劑盒檢測有1例為陽性,因此免疫球蛋白會對自產試劑盒存在干擾,該原因主要是購買的抗體沒有經過純化,可能存在非特異性結合。檢測抗干擾能力為98.5%,比成品試劑盒較差,但是完全可以滿足臨床要求。

    表1 對70例病理陽性樣本檢測結果

    (3)線性相關性檢測。通過BIOBΑSE8001全自動酶免工作站對顯色強度進行檢測,根據(jù)統(tǒng)計的吸光強度獲得線性關系如圖1所示。以美國ortho公司的檢測結果為橫坐標,以自產試劑盒的檢測結果為縱坐標,進行直線回歸統(tǒng)計分析,得回歸方程為y=0.8878x+0.0007,r=0.9976, r>0.990,可以認為兩種方法具有極佳的相關性。

    3 結論

    通過過碘酸鈉方法,用辣根過氧化物酶對丙型肝炎病毒核心抗原的抗體進行標記,結合美國ortho公司的丙型肝炎病毒核心抗原檢測試劑盒的組分,組裝了自產的試劑盒,用以對丙型肝炎病毒核心抗原進行檢測。通過對比美國ortho公司的試劑盒,進行準確度、特異性和相關性的分析,兩試劑盒檢測陰陽性符合率達到100%,抗干擾性為98.5%,線性相關系數(shù)r=0.9976。該研究對國內臨床對于丙型肝炎的檢測具有潛在的應用價值。

    [1]Bux-Gewehr I,Schmandt S,Zotz RB,et a1.Long-term hepatitis C seroconversion in a blood donor[J].Transfusion,2001,41(03)∶427.

    [2]王國華,張賀秋,李少波等.雙抗原夾心與間接酶聯(lián)免疫法檢測抗-HCV雙比研究 [J].中國醫(yī)學檢驗雜志,2005,6(04)∶318.

    [3]Widell A, Molnegren V, Pieksma F, et a1. Detection of hepatitis C core antigen in serum or plasma as a marker of hepatitis C viraemia in the serological window-phase [J]. Transfus Med, 2002,12(02)∶107-113.

    10.16640/j.cnki.37-1222/t.2016.19.224

    劉旭(1985-),男,山東成武人,本科,助理工程師,研究方向:醫(yī)療器械。

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